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调节ATP-敏感性钾通道功能的药物与内源性物质对脑线粒体呼吸功能的影响及其分子机制

作　者: 赵刚
导　师: 龙超良；汪海
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 线粒体呼吸功能线粒体ATP-敏感性钾通道埃他卡林纳他卡林内源性物质镁离子钙离子
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脑血管病,特别是其中最为常见的缺血性脑血管疾病严重危害人类健康。而溶栓后的再灌注过程可进一步加重缺血组织损伤。缺血及再灌注损伤的机制可能涉及能量代谢障碍、自由基损伤、细胞内及线粒体内钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应、线粒体损伤及细胞凋亡等。其中,对线粒体功能变化的研究成为心脑缺血性疾病研究领域的热点。线粒体（mitochondrion）是一种结构和功能复杂而敏感的细胞器,其主要功能之一是氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）。氧化磷酸化是需氧细胞生命活动的主要能量来源,是生物体产生ATP的主要途径。因此缺血及再灌注损伤涉及的能量代谢障碍主要与线粒体的结构受损,氧化磷酸化能力下降或丧失有关,保护线粒体功能和结构的完整是药物发挥抗脑缺血活性的关键机制之一[1,2,3,4]。线粒体ATP-敏感性钾通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP）自发现以来,其在缺血（再灌注）损伤及预适应中的作用备受关注。已经证实,mitoKATP通道开放后可通过多种机制保护缺血组织,减轻缺血缺氧及再灌注损伤[5,6,7]。因此,寻找新型mitoKATP通道开放剂,可能意味着寻找到新型神经及心脏保护药。脑缺血（再灌注）可引起脑内离子稳态失衡,导致神经细胞内和线粒体内Ca²⁺超载。线粒体内升高的Ca²⁺可通过诱导和加重活性氧（reactive oxygen species,ROS）的形成,开放线粒体通透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore,mPTP）,促进线粒体内凋亡相关因子释放等复杂的机制[8],最终诱导细胞凋亡,引起组织损伤。失衡的离子稳态引起组织损伤的病理及生化机制备受关注。埃他卡林是新型脂肪胺类ATP-敏感性钾通道开放剂,我室前期研究表明,其具有抗脑缺血损伤的作用[9,10]。纳他卡林是从埃他卡林衍生物中筛选出的选择性更高的ATP-敏感性钾通道开放剂[11]。基于线粒体能量代谢障碍在脑缺血损伤中的重要地位,而线粒体膜上也存在ATP-敏感性钾通道（mitoKATP）,本文以线粒体呼吸功能为主要观测指标,探讨埃他卡林和纳他卡林等药物对脑线粒体呼吸功能的影响及其与mitoKATP的关系,试图寻找新型mitoKATP通道开放剂。并对脑缺血（再灌注）损伤时脑内离子稳态失衡可能涉及的重要的内源性物质——二价金属阳离子对脑线粒体呼吸功能的影响作初步探究,思考其在脑缺血时引起病理损伤可能的生化机制。一、调节ATP-敏感性钾通道功能的药物对脑线粒体呼吸功能的影响1.大鼠脑线粒体呼吸功能特征（1）采用差速离心法,提取大鼠脑皮层线粒体。采用Clark氧电极法测定脑线粒体呼吸功能。所得线粒体结构完整,氧化磷酸化功能活性良好,可用于评价药物对其呼吸功能的影响。（2）NADH呼吸链的耗氧速率,即电子传递速率低于FAD链（P<0.001）,但呼吸控制率高于FAD链（P<0.05）。NADH呼吸链的P/O高于FAD呼吸链（P<0.01）。两条呼吸链的OPR相近,即ATP合成的效率接近。（3）线粒体反应体系中,ADP消耗完以后曲线的斜率R4′大于ADP加入前的曲线斜率R4（P<0.05）,体现了呼吸链对线粒体内膜两侧H+梯度降低的补偿能力。本文首次提出补偿指数（compensatory index,CI）的概念。NADH呼吸链的CI高于FAD呼吸链（P<0.01）。2.埃他卡林和纳他卡林等药物对脑线粒体呼吸功能的影响（1）二氮嗪可显著抑制琥珀酸的氧化（P<0.01）,而显著加快苹果酸和谷氨酸的氧化（P<0.05）。二氮嗪对FAD呼吸链的R3和R4呼吸过程均有抑制作用（P<0.01,P<0.05）,但不影响RCR。二氮嗪可增大FAD呼吸链的P/O（P<0.01）,但由于对R3的抑制更明显,使OPR降低（P<0.05）。不加外源性底物,在ATP存在时,在R4呼吸状态加入二氮嗪可显著增大脑线粒体耗氧速率（14.20±4.21）%（P<0.01）。二氮嗪可减小脑线粒体悬液在540nm处的吸光值（P<0.05）,其作用可被5-HD拮抗,显示了其开放mitoKATP通道的作用。（2）埃他卡林可抑制琥珀酸的氧化（P<0.05）,加快苹果酸和谷氨酸的氧化（P<0.05）。其对NADH呼吸链的R3呼吸没有影响,可加快R4呼吸（P<0.05）,减小RCR（P<0.01）,增大P/O和OPR（P<0.01,P<0.05）。埃他卡林对FAD链显示不同的作用特点,即不影响R4,而加快R3（P<0.01）,使RCR增大（P<0.05）,不影响P/O和OPR。埃他卡林对两条呼吸链的CI均有增强作用（P<0.05）。不加外源性底物,在ATP存在时,在R4或R4′呼吸状态加入埃他卡林均可显著增大脑线粒体耗氧速率（P<0.05）。（4）纳他卡林可加快苹果酸和谷氨酸的氧化（P<0.05）,抑制琥珀酸的氧化（P<0.05）,且其抑制琥珀酸氧化的作用可被5-HD拮抗,说明纳他卡林抑制琥珀酸氧化的作用与其开放mitoKATP通道有关。纳他卡林对NADH呼吸链的R3呼吸没有影响,可加快R4呼吸（P<0.05）,减小RCR（P<0.05）,增大P/O和OPR（P<0.05,P<0.01）。纳他卡林可增大FAD呼吸链的RCR（P<0.05）。纳他卡林对NADH呼吸链和FAD呼吸链的CI均有增强作用（P<0.05,P<0.01）。不加外源性底物,在ATP存在时,在R4′呼吸状态加入纳他卡林可显著增大脑线粒体耗氧速率（7.58±2.76）%（P<0.05）,其作用可被5-HD拮抗（P<0.05）。纳他卡林可减小脑线粒体悬液在540nm处的吸光值（P<0.001）,其作用可被5-HD拮抗（P<0.001）。证明纳他卡林对mitoKATP通道有开放作用。（5）5-HD本身对脑线粒体呼吸功能有影响。表现在加快基础耗氧（P<0.01）,增大P/O、OPR和CI（P<0.05,P<0.05,P<0.01）。硝苯地平对脑线粒体R4呼吸没有显著影响,对R3、RCR、P/O和OPR均有抑制作用（P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01）。二、重要的内源性物质——二价金属阳离子对线粒体呼吸功能的影响1.镁离子对线粒体呼吸功能的影响（1）Mg²⁺可加快脑线粒体基础耗氧（15.90±13.74）%（P<0.05）,埃他卡林可增强其作用（P<0.05）,此时,Mg²⁺可使脑线粒体基础耗氧速率增大（44.50±9.50）%（P<0.05）。在ATP存在时,Mg²⁺可急剧加快脑线粒体耗氧速率（P<0.001）,迅速造成体系氧耗竭。（2）5-HD可浓度依赖性地部分拮抗Mg²⁺能量依赖性加速耗氧的效应。硝苯地平对Mg²⁺能量依赖性加速耗氧的效应没有影响。呼吸链抑制剂鱼藤酮可完全阻断Mg²⁺能量依赖性加速耗氧的效应。（3）Mg²⁺对心肌、肝脏和肾的线粒体也有能量依赖性加速耗氧的作用。说明,Mg²⁺能量依赖性加速线粒体耗氧的现象有一定的普遍性。2.钙离子对脑线粒体呼吸功能的影响Ca²⁺可在ATP存在时显著加快脑线粒体耗氧速率（P<0.05）,其增大幅度小于Mg²⁺。5-HD和硝苯地平都不影响Ca²⁺能量依赖性加快耗氧的效应。3.钡离子和锌离子对脑线粒体呼吸功能的影响ATP存在时,Ba²⁺可明显加快脑线粒体耗氧速率。与Mg²⁺和Ca²⁺相比,其效能较低。ATP存在时,Zn²⁺没有加快脑线粒体耗氧速率的效应,反而使耗氧完全停止。4.钙离子和钡离子对镁离子能量依赖性加速耗氧效应的影响Ca²⁺和Ba²⁺均可明显抑制Mg²⁺能量依赖性加速耗氧的效应。5.镁、钙、钡离子对CCCP引起的无效呼吸作用——解偶联效应的影响Ca²⁺和Ba²⁺均可抑制CCCP引起的无效耗氧——解偶联效应。Mg²⁺对CCCP的解偶联效应没有影响。基于以上实验结果,本文提出以下主要观点:1.本文首次提出补偿指数的概念。即线粒体反应体系中,ADP消耗完以后曲线的斜率R4′大于ADP加入前的曲线斜率R4,我们建议将R4′和R4比值定义为“补偿指数”,其意义在于呼吸链通过三个质子泵（复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ）向膜间隙泵出H+,补偿H+电化学梯度降低的能力。NADH呼吸链的补偿指数高于FAD呼吸链。2.埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪均可抑制琥珀酸的氧化,而加快苹果酸和谷氨酸的氧化。其中纳他卡林抑制琥珀酸氧化的作用与其开放mitoKATP通道有关。三者均可对脑线粒体呼吸功能各项参数产生影响,但彼此之间存在差异。3.纳他卡林可开放脑线粒体ATP-敏感性钾通道,为新结构类型的mitoKATP通道开放剂。4.镁离子可加快脑线粒体耗氧,埃他卡林可增强其作用。镁离子、钙离子和钡离子均可能量依赖性加快脑线粒体耗氧,锌离子没有此效应,反而可使线粒体耗氧完全停止。镁离子对脑、心肌、肝脏和肾线粒体均有能量依赖性加速耗氧的效应。钙离子和钡离子可拮抗镁离子的作用。钙离子和钡离子可拮抗解偶联剂CCCP引起的无效呼吸作用,镁离子没有此效应。

调节ATP-敏感性钾通道功能的药物与内源性物质对脑线粒体呼吸功能的影响及其分子机制

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