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多巴胺D3受体阻断剂抗成瘾作用及机制研究

作　者: 宋睿
导　师: 李锦
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 多巴胺D3受体 Y-QA14 药物成瘾 可卡因
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


药物成瘾是一种长期使用成瘾性药物诱发的慢性、反复发作性脑疾病。尽管成瘾患者知道滥用药物会有严重的不良后果,仍持续地强迫性觅药和用药。从世界范围内看,成瘾已经成为严重危害人类健康和社会稳定的重大问题,但至今仍无有效的治疗药物和治疗手段,其根本原因在于成瘾的神经生物学机制尚不清楚。因此,深入研究成瘾的神经生物学机制、研发有效的抗成瘾防复吸药物,始终是医学生物学研究的热点问题,具有重要的科学价值和社会意义。多巴胺（Dopamine, DA）是中枢神经系统最重要的神经递质之一,通过激活巴胺受体,参与运动调节、情感、认知、药物成瘾、神经内分泌调节等生命活动。多巴胺D3受体（Dopamine D3 receptor, D3R）是较晚发现的一类多巴胺受体亚型。D3R主要表达在哺乳动物脑内边缘系统,特别是Callejia岛、伏隔核（Nucleus Accumbens, NAc）和嗅结节,少量分布在背侧纹状体、杏仁核和大脑皮质,这些部位是运动、认知,情感和奖赏等功能的关键解剖结构,提示D3R可能与药物依赖、帕金森病和精神分裂症等重大疾病密切相关。但由于D3R与D2R的高度同源性,目前尚缺乏高选择性D3R配体,导致其生理与病理作用难以得到有效的阐明。近年来随着选择性D3R配体的研发,在理解D3R功能和以其为药靶达到疾病治疗目的等方面取得了积极进展。研究表明,多巴胺D3R选择性阻断剂,如BP-897、SB-277011A及NGB2904等,能显著降低成瘾药物的奖赏效应及抑制复吸的发生,提示D3R在调控成瘾的形成和复发中发挥重要作用。尽管如此,上述化合物由于存在选择性不高（可能导致锥体外系不良反应）、半衰期短等一系列问题,限制了它们的进一步临床应用。本课题旨在研发新型高亲和力、高选择性的D3R阻断剂,并详尽评价候选化合物预防治疗可卡因成瘾的药效学作用及其作用机制、以及药代动力学特征。同时,以高选择性D3R阻断剂和D3R基因敲除小鼠为工具,探讨D3R调节成瘾的机制。本课题的主要发现如下:1.新型高亲和力和高选择性D3R阻断剂—Y-QA14的发现首先,建立30种G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors, GPCR）稳定或瞬时转染的体外表达细胞体系（包括多巴胺受体5个亚型、腺苷受体2个亚型、乙酰胆碱M型受体5个亚型、5-羟色胺受体6个亚型、组胺受体3个亚型、肾上腺素受体4个亚型、阿片受体3个亚型及大麻受体2个亚型）,成为目前国内较为齐全的G蛋白偶联受体药物筛选平台。其次,采用放射性配体受体结合实验,采取浓度梯度筛选的方式,得到4个对D3R具有高亲和力的苯并噁唑啉-2-酮-甲酰胺类化合物,其亲和力Ki分别为:Y-QA14 ( Ki-High:0.68×10-4 nM,Ki-Low:2.11 nM )、Y-QA16 （26.5 nM）、Y-QA20 （14.8 nM）及Y-QA29 （6.89 nM）。同时,比较了该类化合物对D2R的亲和力,Ki值分别为Y-QA14 （335.3 nM ）、Y-QA16 （95.6 nM ）、Y-QA20 （1990 nM ）和Y-QA29 （157.08 nM）, D3R/D2R选择性分别为4×106和158倍（Y-QA14）、3.6倍（Y-QA16）、134倍（Y-QA20）和23倍（Y-QA29）。在这些研究工作基础上,进一步比较得到该系列化合物对其他28种GPCR的亲和力。结果发现Y-QA14对绝大多数GPCR的选择性大于4×106倍（高亲和力位点）和200倍（低亲和力位点）。最后用35S-GTP?S结合功能实验证实新型化合物Y-QA14不具备激动D3R的活性,是D3R的阻断剂。综上所述,通过与目前国际上标杆药NGB2904比较,发现Y-QA14结合D3R的Ki是NGB2904的6.4×105（高亲和力位点）和2.0倍（低亲和力位点）,D3R/D2R选择性是NGB2904的25800倍（高亲和力位点）和1.01倍（低亲和力位点）,成为迄今为止亲和力和选择性最高的D3R阻断剂。Y-QA14有望成为研究D3R功能的新一代高选择性的工具药。2. Y-QA系列药代动力学性质初步探索性研究药代性质欠佳是目前D3R阻断剂研究中的瓶颈问题之一。SB-277011A作为D3R阻断剂是目前国际上该类化合物中防复吸药效作用最显著标杆药,但在灵长类动物中的口服半衰期小于20min,无法进入临床研究。基于此问题,初步评价了该类新型化合物的药代学性质。研究发现,苯并噁唑啉-2-酮-甲酰胺类化合物中Y-QA14、Y-QA20及Y-QA29的生物利用度分别为40.46%、82.05%和42.12%;在人源肝微粒体酶体外孵育模型中,Y-QA14、Y-QA16、Y-QA20及Y-QA29孵育2小时后的剩余药量分别为81.8%、73.0%、53.3%及66.9%,提示Y-QA系列化和物在灵长类动物中的代谢稳定性比较好,其口服半衰期极可能高于国际标杆药SB-277011A。以上结果初步证实Y-QA系列化合物的结构重建成功,突破了D3R阻断剂体内半衰期短的瓶颈,为进入临床应用迈进一大步。3. Y-QA14抗可卡因精神依赖和复吸研究目前对于阿片类物质、酒精及尼古丁成瘾的治疗已有药物上市,但对于精神类兴奋剂如可卡因等至今尚有效药物问世,这已成为全世界研发的热点和难题。所以针对D3R在多巴胺系统中的特异性分布及功能,我们对新型D3R阻断剂Y-QA14在多种可卡因依赖动物模型中的药理学作用及其可能作用机制进行详细研究和探讨,希望为可卡因成瘾的治疗提供有力的工具。研究发现:（1）Y-QA??具备抗可卡因成瘾及复吸的作用:在可卡因成瘾正性强化模型上,1)抗电刺激奖赏作用:在大鼠脑内电刺激奖赏（Intracranial Brain-Stimulation Reward, BSR）模型中,Y-QA??（???mg/kg）本身无强化或抑制作用,但显著抑制可卡因引起的奖赏增强的效应,提示Y-QA??阻断D3R不产生正性强化作用,不具可卡因主观样效应,但能减弱其正性强化作用。2)抗可卡因诱导的大鼠自身给药行为:首先,Y-QA14本身不能诱导大鼠自身给药行为（Self-Administration, SA）,也不能替代可卡因成瘾大鼠觅药行为。同时,在可卡因在固定比率（Fixed-Ratio,FR）程序中,Y-QA14（6.25, 12.5, 25 mg/kg）与标杆药SB-277011A（12.5, 25 mg/kg）一样均能剂量依赖地降低可卡因的量效曲线,使其向右下移动;在累进比率（Progressive-Ratio, PR）给药模型中,Y-QA14（1.04, 6.25, 12.5 mg/kg）剂量依赖地显著降低断点（Break Point）,起效剂量明显低于标杆药SB-277011A的6 mg/kg。最后在蔗糖自身摄取实验中,Y-QA14不影响大鼠的蔗糖觅食行为。表明Y-QA14本身无成瘾性,在抑制可卡因奖赏效能的同时不损伤生理性欣快,而且起效剂量优于SB-277011A。3)抗可卡因诱导的大鼠行为敏化形成:在大鼠行为敏化（Behavior Sensitization）模型中,Y-QA14 （12.5, 25 mg/kg）剂量依赖地抑制行为敏化的形成,但不影响大鼠的自发活动和可卡因（10 mg/kg）的急性刺激引发的高活动性,表明Y-QA14能够抑制可卡因奖赏效应的敏化,提示D3R可能参与成瘾神经可塑性的发生。（2）防可卡因复吸作用更为重要的是在药物复吸（Relapse）模型中,结果显示:1)抗可卡因成瘾大鼠觅药消退（Extinction Training）行为,Y-QA14 （12.5, 25 mg/kg）能显著缩短成瘾大鼠消退训练达到平台期的时程,表明Y-QA14能抑制大鼠强迫觅药的行为,提示D3R可能参与了成瘾强迫性觅药行为的调控。2)抗药物诱发复吸行为,Y-QA14（12.5, 25 mg/kg）显著降低大鼠踏板觅药的次数,抑制可卡因诱导的复吸行为。3)抗相关环境线索诱发复吸行为,Y-QA14（25 mg/kg）能显著抑制3天、7天及14天自然戒断大鼠重现实验环境后诱发的复吸行为。4)抗可卡因诱导的大鼠行为敏化表达,Y-QA14 （20, 25 mg/kg）显著抑制可卡因诱导的行为敏化的表达。（3）抗可卡因精神依赖受体机制研究1)小鼠自身给药模型:D3R基因敲除型小鼠能形成可卡因自身给药行为,但单位时间内的用药量显著高于野生型小鼠,而且可卡因的量效曲线向上移动。药理学研究发现,Y-QA14（25, 50 mg/kg）和SB-277011A（50, 100 mg/kg）显著抑制野生型小鼠的可卡因诱发的自身给药行为,而对D3R敲除型小鼠无效。以上结果表明:D3R基因敲除后,机体对可卡因的奖赏作用减弱促使觅药行为的代偿性增高;新型化合物Y-QA14选择性地阻断D3R减弱可卡因的奖赏效应从而抑制成瘾。2)小鼠条件性位置偏爱模型（Conditioned Place Preference, CPP）:D3R基因敲除型小鼠能形成条件性位置偏爱行为,略低于野生型小鼠无显著性差异。药理学研究发现,Y-QA14（50 mg/kg）显著降低和抑制可卡因诱发野生型小鼠CPP形成和表达,但对D3R敲除型小鼠无效。以上结果表明,Y-QA14通过选择性地作用于D3R抑制可卡因成瘾的异常学习记忆。综上所述,本文筛选获得了具有自主知识产权的高亲和力、高选择性的D3R阻断剂Y-QA14。通过体外系统的选择性评价和体外药代动力学的检测,提示Y-QA14具有良好的选择性和药代学的稳定性。在可卡因成瘾的动物模型上证实,Y-QA14本身不具有致依赖潜能、也不影响自然奖赏,但通过特异性拮抗D3R抑制成瘾的发生、发展及复吸;首次利用D3R敲除型小鼠探讨了D3R在成瘾中可能的特异性作用。通过本课题的研究,为阐明D3R在成瘾中的作用以及研发D3R阻断剂治疗成瘾及复吸提供了实验依据。

全文目录


缩略语  7-9
中文摘要  9-14
英文摘要  14-17
第一章 前言  17-24
  1. 药物成瘾的危害和研究意义  17
  2. 成瘾的神经生物学基础及多巴胺系统发挥的重要作用  17-20
  3. 国内外治疗成瘾的药物应用现状  20-21
  4. 治疗毒品成瘾的选择性 D_3R 阻断剂研发进展  21-24
第二章 新型多巴胺D3受体阻断剂筛选  24-49
  1. 研究背景  24-26
  2. 材料与方法  26-32
    2.1 实验材料  26-27
    2.2 实验方法  27-32
  3. 结果  32-44
    3.1 hD_3R 在 CHO 细胞中稳定表达  32-35
    3.2 G蛋白偶联受体体外表达体系的建立  35-36
    3.3 新型高亲和力高选择性化合物的初步筛选  36-42
    3.4 苯并噁唑啉-2-酮-甲酰胺类化合物对其余 GPCR 的结合力比较  42-43
    3.5 新型高亲和力高选择性化合物 Y-QA14 的活性确定  43-44
  4. 讨论  44-48
  5. 小结  48-49
第三章 新型多巴胺D3受体阻断剂药代性质研究  49-55
  1. 研究背景  49
  2. 材料与方法  49-51
    2.1 材料  49
    2.2 实验方法  49-51
  3. 结果  51-53
    3.1 Y-QA 系列化合物口服半衰期及生物利用度良好  51-52
    3.2 Y-QA 系列化合物体外肝微粒体酶中代谢稳定  52-53
  4. 讨论  53-54
  5. 小结  54-55
第四章 新型多巴胺D3受体阻断剂抗成瘾作用及机制研究  55-89
  1. 研究背景  55
  2. 材料与方法  55-61
    2.1 新型化合物Y-QA14抗成瘾防复吸作用评价  56-60
      2.1.1 Y-QA14抗可卡因正性强化作用评价  56-59
        2.1.1.1 大鼠脑电刺激奖赏模型  56
        2.1.1.2 大鼠自身给药模型  56-58
        2.1.1.3 大鼠行为敏化形成实验  58-59
      2.1.2 Y-QA14防可卡因复吸评价  59-60
        2.1.2.1 戒断觅药训练实验  59
        2.1.2.2 药物诱导复吸实验  59
        2.1.2.3 相关线索诱导复吸实验  59
        2.1.2.4 大鼠行为敏化表达实验  59-60
    2.2 抗成瘾作用机制研究  60-61
      2.2.1 D3受体敲除小鼠自身给药模型  60
      2.2.2 D3受体敲除小鼠条件性位置偏爱模型  60-61
  3. 结果  61-81
    3.1 新型化合物Y-QA14显著抑制可卡因成瘾  61-73
      3.1.1 Y-QA14显著降低抗可卡因正性强化作用  61-70
        3.1.1.1 Y-QA14显著抑制可卡因诱发脑内电刺激奖赏作用  61-63
        3.1.1.2 Y-QA14显著抑制可卡因自身觅药行为  63-68
        3.1.1.3 Y-QA14显著抑制可卡因诱导行为敏化形成  68-70
      3.1.2 新型化合物Y-QA14显著抑制可卡因复吸发生  70-73
        3.1.2.1 Y-QA14显著抑制戒断觅药行为  70-71
        3.1.2.2 Y-QA14显著抑制药物诱发复吸行为  71
        3.1.2.3 Y-QA14显著抑制线索诱发复吸行为  71-73
        3.1.2.4 Y-QA14显著抑制可卡因诱导行为敏化表达  73
    3.2 Y-QA14 选择性阻断体内 D_3R 抑制可卡因的成瘾  73-81
      3.2.1 Y-QA14选择性抑制野生型小鼠自身给药行为  74-78
      3.2.2 Y-QA14选择性抑制野生型小鼠条件性位置偏爱形成与表达  78-81
  4. 讨论  81-87
  5. 小结  87-89
第五章 总结讨论  89-93
  1. 讨论  89-92
  2. 结论  92-93
参考文献  93-102
附录1  102-109
附录2  109-113
综述  113-123
  参考文献  119-123
在读期间发表的代表性论文  123-139
个人简历  139-140
致谢  140

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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