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埃他卡林选择性抗高血压作用分子机制的研究

作　者: 黄景慧
导　师: 汪海
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 阻力血管埃他卡林选择性 ATP敏感性钾通道开放剂内皮依赖性扩张作用
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

高血压是严重危害人类健康的常见病和多发病，全球有超过10亿高血压病人需要终身服药[1]，目前已成为心脑血管疾病发病的首要危险因素，防治形势十分严峻[2、3]。就病因而言，高血压主要是由于血管总外周阻力增加所致[4]。阻力血管由小动脉和微动脉构成，这两类血管过度收缩所致的压力增高是高血压发生和发展最基本的病理生理机制[5]。因此，高选择性调控阻力血管是治疗高血压的根本[6]。遗憾的是，在将近300种高血压药物中，尚没有一种药物对阻力小动脉和微动脉有高选择性扩张作用。血管扩张剂作为一类重要的抗高血压药物，如钙拮抗剂等，广泛应用于高血压治疗，然而在扩张阻力血管的同时不可避免地扩张大动脉和容量血管，引起心跳加快、水钠潴留等不良反应[7]。因此，研究选择性扩张阻力血管的药物具有重要的价值。ATP敏感性钾通道（ATP-sensitive potassium channel, KATP）是调节阻力血管张力重要的药物靶标之一。埃他卡林（Ipt）是一种新结构类型的KATP开放剂[8]。临床前的大量药理学研究表明埃他卡林降压作用平稳持久；能保护高血压所致的心、肾、脑等重要靶器官损伤[9]，逆转心血管重构[10]，改善高血压相关胰岛素抵抗[11]；逆转多种心血管危险因素所致的内皮细胞功能紊乱，具有强效内皮保护作用[12]，其分子机制与其纠正内皮细胞一氧化氮（NO）和内皮素-1（ET-1）系统功能的失衡和激活Chemerin/ChemR23系统有关[13]。近期研究结果表明，Ipt可以选择性开放SUR2B/Kir6.1亚型的KATP通道，而阻力血管SUR2B/Kir6.1亚型的KATP通道高表达[14、15]，可以推测Ipt可能对阻力血管张力具有选择性调控作用。因此，本论文研究目的为：研究Ipt对阻力血管的扩张特点；并以Ipt为工具药，研究其扩张血管作用分子机制。我们首先应用KCl致预收缩的大鼠肠系膜微动脉模型和高灌注压模拟阻力血管张力增高模型，研究发现Ipt对大鼠不同组织中阻力血管的扩张强度不同，顺序为：肠系膜微动脉＞软脑膜＞肺＞骨骼肌。因此选择肠系膜微动脉作为进一步研究对象。由于阻力血管管径越小，其对总外周阻力的贡献越大。而我们在80mmHg灌注压下发现，随着肠系膜动脉的管径越小，Ipt的扩张作用越强，说明Ipt对阻力血管扩张作用具有选择性。在肠系膜微动脉的正常生理灌注压（20mmHg）下，Ipt没有扩血管作用，随着压力增高，其扩张作用变强，这也与临床试验中Ipt常规治疗并不降低血压正常受试者的血压，而对高血压的病人则具有强效降压作用的结果一致。血管内皮功能障碍与高血压关系密切，目前尚没有靶向改善血管内皮功能、副作用低的抗高血压药物出现。如血管紧张素转化酶抑制剂（ACEIs）有效成分缓激肽（BK）及P物质（SP）虽通过内皮产生舒血管作用，但因其产生干咳等副作用限制临床应用。因此，研究改善血管内皮活性，副作用小的抗高血压药物具有重要意义。阻力血管由内皮细胞和平滑肌细胞两类细胞组成。在去内皮的微动脉环上，Ipt的扩血管作用大幅度降低，提示除了直接扩张平滑肌细胞外，Ipt对阻力血管的扩张作用具有明显的内皮依赖性。PGI₂，NO和EDHF是目前报道的参与介导内皮依赖性扩血管作用三类重要的扩张因子。本研究首先证明，不同于临床对血管有扩张作用的抗高血压药物，如血管紧张素转移酶抑制剂（ACEIs）促进释放的缓激肽（BK）、P物质（SP），Ipt扩血管作用与PGI₂无关，而与其促进EDRF即NO释放有关。在进一步NO通路研究中，我们发现Ipt介导的扩血管作用可被钙调素（CaM）抑制剂卡米达唑（CMZ）抑制，也可被可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）抑制剂ODQ抑制，提示Ipt激活内皮细胞KATP后通过Ca2+/CaM激活eNOS活性，促进NO释放，并通过NO-sGC-cGMP的分子途径介导平滑肌扩张；目前，H2O2、H2S、EETs和K⁺都被认为可能是EDHF。本研究发现K⁺作为唯一的EDHF介导了Ipt引起的EDHF-样扩血管作用，而与其他几种EDHFs无关，这完全不同于经典的乙酰胆碱（ACh）、BK及SP诱导的内皮依赖性舒血管反应。当EDRF抑制剂与EDHF抑制剂合用时，Ipt的扩血管作用与去内皮后的扩张作用相当，再次证明Ipt激活内皮细胞KATP后，主要影响NO释放和激活内皮表达的I/SKCa通道介导内皮依赖性扩血管作用。在血管组织中主要表达有Kir、Kv、BKCa和KATP四类钾通道，他们在调节血管张力中均起重要作用[16]。本研究中发现Kir通道、Kv通道及BKCa通道均不参与Ipt诱导的扩血管作用；而膜KATP通道特异性阻断剂Gli则可以显著拮抗Ipt的作用，提示Ipt扩血管作用与开放细胞膜KATP通道相关。在不同的组织上，KATP通道亚型的组成和分布并不相同且功能各异。通常认为胰腺β细胞KATP由SUR1/Kir6.2构成，参与了胰岛素分泌和血糖代谢的调节；心肌细胞膜KATP由SUR2A/Kir6.2构成，参与了心肌缺血预适应，改善心肌能量代谢等心脏保护机制；而血管组织（包括平滑肌和内皮细胞）KATP主要由SUR2B/Kir6.1构成，其特性较为复杂，不同部位血管对不同KATP通道开放剂的反应并不一致。目前临床上用于抗高血压的KATP开放剂，虽然具有降压作用，但因组织选择性差和KATP的亚型选择性不高，不可避免地产生诸多副作用。因此，我们认为靶向SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道开放剂可以高选择性调控阻力血管张力，同时可避免临床KATP开放剂由于组织选择性差和KATP的亚型选择性不高引起的不良反应的发生。我们进一步在Kir6.1基因敲除小鼠模型发现Ipt扩血管作用完全消失；在直接去内皮以及药理学去内皮的情况下，Gli可以完全阻断Ipt直接扩张平滑肌的作用，以上结果表明Ipt是通过激活Kir6.1亚型KATP通道扩张阻力血管的。结合前期研究工作和目前的发现，我们提出了靶向SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道开放剂Ipt阻力血管张力调控新的分子机制：30%扩血管作用来自Ipt直接激活平滑肌细胞KATP，导致细胞内K⁺外流，细胞膜超极化，阻断电压依赖性钙通道，降低细胞内游离钙离子浓度，引起血管平滑肌松弛，从而扩张血管。70%扩血管作用主要源于Ipt激活内皮细胞KATP，引起细胞膜超极化。由于内皮细胞内不表达电压依赖性钙通道，而表达受体操控的阳离子通道（ROCC），膜超极化可以导致ROCC开放，胞内游离钙离子浓度升高，并通过钙离子-钙调素增强eNOS的活性，增加EDRF（NO）的释放，通过NO-sGC-cGMP通路影响平滑肌内游离钙离子浓度，从而引起血管平滑肌松弛，EDRF对Ipt扩张阻力血管的贡献约为30%。另一方面，Ipt可促进内皮细胞释放唯一的EDHF即K⁺，进一步造成平滑肌细胞膜的超极化，关闭平滑肌电压依赖性钙通道，引起血管扩张，K⁺参与扩张阻力血管的贡献约为40%。除此之外，Ipt引起的内皮细胞膜超极化还可能通过内皮-平滑肌之间的缝隙连接即（myoendothelial gap junctions, MEGJ），将电信号传递到平滑肌细胞，介导血管扩张反应。平滑肌细胞膜超极化还会通过MEGJ进一步使内皮细胞膜超极化，它们之间形成正性循环。综上所述，内皮细胞EDHF（K⁺）、EDRF（NO）与平滑肌细胞KATP参与Ipt扩张阻力血管的贡献比例约为4:3:3，这不同于任何一个高血压治疗药物。

全文目录

缩略词表  6-8
摘要  8-11
ABSTRACT  11-14
前言  14-17
第一部分埃他卡林抗高血压机制的选择性扩血管作用特征  17-38
  前言  17-19
  材料与方法  19-23
    1 实验材料  19-20
      1.1 实验动物  19
      1.2 主要药品及试剂  19
      1.3 主要仪器设备  19-20
    2 实验方法  20-23
      2 . 1 氯化钾致大鼠肠系膜微动脉预收缩模型实验  20-21
      2.2 大鼠阻力血管压力超负荷模型实验  21-22
      2.3 结果处理与统计分析  22-23
  实验结果  23-34
    1 埃他卡林抗高血压机制的选择性扩血管作用特征  23-29
      1.1 埃他卡林对氯化钾致预收缩大鼠肠系膜微动脉舒张作用特征  23-25
      1.2 埃他卡林对压力超负荷大鼠不同组织、不同管径及不同灌注压微动脉扩张作用特征  25-29
    2 埃他卡林与吡那地尔、氨氯地平、硝苯地平、氢氯噻嗪对大鼠系膜微动脉扩张作用特征的比较  29-32
    3 高血压状态埃他卡林的扩血管作用特征  32-34
  讨论  34-37
  小结  37-38
第二部分埃他卡林选择性扩血管作用内皮依赖性分子途径的研究  38-59
  前言  38-42
  材料与方法  42-45
  实验结果  45-55
    1 埃他卡林选择性扩血管内皮依赖性扩张作用特征  45-46
      1.1 埃他卡林对氯化钾致预收缩阻力血管内皮依赖性扩张作用  45
      1.2 埃他卡林对压力超负荷阻力血管内皮依赖性扩张作用  45-46
    2 埃他卡林选择性扩血管作用内皮依赖性分子途径的研究  46-55
      2.1 前列环素通路对埃他卡林选择性扩血管作用的影响  46-48
      2.2 内皮源性舒张因子对埃他卡林选择性扩血管作用的影响  48-51
      2.3 内皮源性超级化因子对埃他卡林选择性扩血管作用的影响  51-55
      2.4 内皮源性舒张因子联合内皮源性超级化因子对埃他卡林选择性扩血管作用的影响  55
  讨论  55-58
  小结  58-59
第三部分埃他卡林选择性扩血管作用分子靶标的研究  59-79
  前言  59-60
  材料与方法  60-63
  实验结果  63-76
    1 不同钾离子通道抑制剂对埃他卡林选择性扩血管作用的影响  63-64
    2 ATP 敏感性钾离子通道抑制剂对埃他卡林选择性扩血管作用的影响  64-66
    3 埃他卡林选择性扩血管作用分子靶标的研究  66-71
      3.1 埃他卡林对 Kir6.1-/ -小鼠阻力血管扩张作用特征  66-68
      3.2 埃他卡林选择性扩血管作用分子靶标的研究  68-71
    4 埃他卡林对不同管径血管扩张作用分子靶标的研究  71-76
  讨论  76-78
  小结  78-79
结论  79-81
参考文献  81-91
综述  91-98
  参考文献  96-98
附录  98-105
个人简历  105-106
致谢  106

埃他卡林选择性抗高血压作用分子机制的研究

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