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Beagle犬血清中HS203的微量分析及初步药代动力学研究

作　者: 孙淑萌
导　师: 赵峡
学　校: 中国海洋大学
专　业: 药物化学
关键词: HS203 柱后衍生高效液相色谱 微量分析 药代动力学 Beagle犬
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 57次
引　用: 2次
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内容摘要


寡聚藻甘酸铬钠（HS203）是一种以抑制胰岛淀粉样蛋白（IAPP）沉积为作用靶点，具有明显改善胰岛素抵抗作用的海洋寡糖化合物，有望开发成为一种新型的海洋抗2型糖尿病药物。由于缺乏一种灵敏有效的微量分析方法，特别是适合于生物体内微量样品分析检测的方法，HS203的药代动力学研究一直未取得突破性进展。本论文分别采用柱前紫外衍生高效液相色谱、柱前荧光衍生高效液相色谱和柱后荧光衍生高效液相色谱三种策略对HS203的微量分析方法进行了系统的研究，并成功测定了Beagle犬血清中HS203静脉注射的药时曲线和药代动力学参数。通过PMP紫外柱前衍生高效液相色谱法的分析，确定了HS203的最适降解条件为温度为110℃，时间4h，TFA浓度为2mol/L；确定了以0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.7）：乙腈（83∶17，V/V）为流动相，在Eclipse XDB-C18色谱柱上进行分离，降解后的HS203与内源性干扰物质能够达到较好的分离效果。将此方法成功地用于Beagle犬静脉注射60mg/kg HS203的药代动力学分析，并计算了各药代动力学参数，结果表明其药时曲线符合二房室开放模型。通过α-萘胺荧光柱前衍生高效液相色谱法的分析，确定了HS203水解为单糖后，在甲醇/冰乙酸=9：1体系中与2mol/L α-萘胺和1.2mol/L氰基硼氢化钠进行衍生反应可得到较好的荧光标记效果，采用乙酸乙酯萃取3次后再进行氮吹可有效去除剩余标记试剂；Ex=291nm，Em=440nm为最佳波长。确定了超滤离心方法为去除血清蛋白的方法，采用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.7）-乙腈（83∶17，V/V）为流动相时，降解后的HS203、内标GalA及血清中的Glc分离度较好，为HS203及其他海洋类寡糖药物的分析奠定了基础。通过盐酸胍荧光柱后衍生高效液相色谱法的分析，确定了柱后最佳衍生条件为：200mmol/L盐酸胍、0.5mol/L氢氧化钠及125℃的衍生温度；采用50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6.7）-乙腈（83∶17，V/V）为流动相，在Shodex AsahipakGS-320HQ色谱柱上进行分离，HS203原型、内标GlcA及内源性干扰物质能够达到很好的分离；以0.25mol/L NaCl溶液进行超滤离心分离，可有效去除内源性杂质的干扰和提高HS203的回收率。该法成功地用于HS203血药浓度分析及初步药代动力学研究，确定了该药的药代动力学符合二房室开放模型，与紫外衍生液相分析方法结果相符。该方法灵敏度高、样品用量少、重现性和准确度较好，操作简单，检测限可达0.2μg/mL，高于HS203的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）银染检测方法。本论文在对Beagle犬血清中HS203的微量分析方法进行研究的基础上，分别建立了一种将HS203进行降解后再进行PMP衍生的微量分析方法和一种对HS203不经降解，直接进行色谱分离和在线检测的柱后荧光衍生分析方法，并将两种方法成功地应用于Beagle犬中HS203的药代动力学分析。特别是建立的柱后荧光衍生分析方法，不仅具有专属性强、灵敏度高，可以检测HS203原型药物的特点，而且还可以同时检测Beagle犬中血糖浓度的变化，为顺利开展HS203的临床研究奠定了基础，同时也为其它海洋糖类药物的研究与开发提供了参考。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章 前言  14-31
  1 糖类药代动力学研究方法  14-16
    1.1 色谱法  14-15
    1.2 免疫学方法  15
    1.3 同位素示踪法  15-16
    1.4 生物检定法  16
  2 寡糖微量分析方法  16-19
    2.1 气相色谱法  17
    2.2 高效液相色谱法  17-18
      2.2.1 紫外检测  17-18
      2.2.2 荧光检测  18
      2.2.3 高效阴离子交换-脉冲安培法检测  18
    2.3 高效毛细管电泳法  18-19
    2.4 质谱法  19
  3 寡糖荧光标记方法  19-29
    3.1 中性糖的荧光标记  20-23
      3.1.1 氨基吡啶类  20
      3.1.2 苯胺类  20-21
      3.1.3 磺酸基类  21-22
      3.1.4 酰肼类  22-23
    3.2 氨基糖的荧光标记  23-26
    3.3 酸性糖的荧光标记  26-29
      3.3.1 含唾液酸的酸性糖  26-27
      3.3.2 含糖醛酸和硫酸基的酸性糖  27-29
    3.4 其他糖类的衍生  29
  4 本论文的立题依据、意义及内容  29-31
第二章 α-萘胺柱前荧光衍生高效液相色谱分析  31-43
  1 材料及仪器  31-32
    1.1 实验材料  31-32
    1.2 主要仪器  32
  2 实验方法  32-35
    2.1 样品的衍生  32-33
      2.1.1 测定波长的选择  32-33
      2.1.2 反应体系的优化  33
      2.1.3 标记试剂用量的优化  33
      2.1.4 萃取试剂的优化  33
    2.2 体外样品的检测  33-34
      2.2.1 药物原型的检测  33
      2.2.2 降解药物的检测  33-34
    2.3 血清中样品的衍生  34-35
      2.3.1 血清样品的处理  34
      2.3.2 血清样品衍生剩余标记试剂的去除  34
      2.3.3 内标条件的优化  34-35
  3 结果与讨论  35-42
    3.1 样品的衍生  35-37
      3.1.1 测定波长的选择  35-36
      3.1.2 反应体系的优化  36
      3.1.3 标记试剂用量的优化  36
      3.1.4 萃取试剂的优化  36-37
    3.2 样品的检测  37-38
      3.2.1 体外药物原型的检测  37-38
      3.2.2 体外降解药物的检测  38
    3.3 血清中样品衍生方法的研究  38-42
      3.3.1 血清样品的处理  38-39
      3.3.2 血清样品衍生剩余标记试剂的去除  39-40
      3.3.3 内标条件的优化  40-42
  4 小结  42-43
第三章 PMP 柱前紫外衍生高效液相色谱分析  43-52
  1 材料及仪器  44
    1.1 实验材料  44
    1.2 主要仪器  44
  2 实验方法  44-47
    2.1 HS203 最佳降解条件的确定  44-45
    2.2 犬血清样品的前处理  45
    2.3 犬血清样品的降解  45-46
    2.4 PMP 衍生化反应  46
    2.5 色谱条件  46
    2.6 标准曲线的绘制  46
    2.7 注射样品的分析  46-47
  3 结果与讨论  47-51
    3.1 HS203 最佳降解条件的确定  47-48
    3.2 犬血清样品的前处理  48
    3.3 样品的降解、衍生和色谱分析  48-49
    3.4 标准曲线的绘制  49-51
  4 结论  51-52
第四章 HS203 柱后荧光衍生高效液相色谱分析  52-79
  1 材料与仪器  53-54
    1.1 实验材料  53
    1.2 主要仪器  53-54
  2 实验方法  54-59
    2.1 样品的衍生  54-55
      2.1.1 衍生试剂的选择  54
      2.1.2 衍生试剂浓度对衍生效率的影响  54-55
      2.1.3 温度对衍生效率的影响  55
      2.1.4 氢氧化钠浓度对衍生效率的影响  55
      2.1.5 硼砂的加入对衍生效率的影响  55
    2.2 血清样品的前处理  55-56
      2.2.1 超滤与乙腈处理的比较  55-56
      2.2.2 超滤次数的比较  56
      2.2.3 超滤处理不同盐浓度的筛选  56
    2.3 色谱柱的筛选  56-57
      2.3.1 Aminex HPX-87H Ion Exclusion 色谱柱  56-57
      2.3.2 Shodex Asahipak GS-320 HQ 色谱柱  57
    2.4 流动相的优化  57
      2.4.1 甲醇比例的调整  57
      2.4.2 各种盐溶液的筛选  57
    2.5 方法学评价  57-59
      2.5.1 标准曲线的制备  58
      2.5.2 回收率实验及检测限  58
      2.5.3 日间、日内精密度实验  58
      2.5.4 稳定性实验  58-59
    2.6 静脉注射样品的检测  59
    2.7 PAGE 法的验证  59
  3 结果与讨论  59-77
    3.1 样品的衍生  59-62
      3.1.1 衍生试剂的选择  59-60
      3.1.2 衍生试剂浓度对衍生效率的影响  60-61
      3.1.3 温度对衍生效率的影响  61
      3.1.4 氢氧化钠浓度对衍生效率的影响  61-62
      3.1.5 硼砂的加入对衍生效率的影响  62
    3.2 血清样品的前处理  62-65
      3.2.1 超滤与乙腈处理的比较  62-63
      3.2.2 超滤次数的比较  63-65
      3.2.3 超滤不同盐浓度的筛选  65
    3.3 色谱柱的筛选  65-67
      3.3.1 Aminex HPX-87H Ion Exclusion 色谱柱  65-67
      3.3.2 Shodex Asahipak GS-320 HQ 色谱柱  67
    3.4 流动相的优化  67-72
      3.4.1 甲醇比例的调整  67-68
      3.4.2 各种盐溶液的筛选  68-72
    3.5 方法学评价  72-74
      3.5.1 标准曲线的制备及线性范围  72-73
      3.5.2 回收率实验及检测限  73
      3.5.3 日间、日内精密度实验  73-74
      3.5.4 稳定性实验  74
    3.6 静脉注射样品的检测  74-77
    3.7 PAGE 法的验证  77
  4 小结  77-79
结语  79-82
  一、主要结论  79-80
  二、创新点  80-82
参考文献  82-92
致谢  92-93
个人简历及参与发表的学术论文  93
  个人简历  93
  参与发表的学术论文  93
  在校期间获得的奖励  93

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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