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基于靶点结构的HIV-1抑制剂和基于分子片段设计的甲硫氨酰tRNA合成酶抑制剂的研究

作　者: 于明艳
导　师: 刘新泳
学　校: 山东大学
专　业: 药物化学
关键词: 艾滋病 HIV-1逆转录酶非核苷类逆转录酶抑制剂二氢烷氧苄基嘧啶酮人类非洲锥虫病甲硫氨酰-tRNA合成酶热熔法
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本论文分三大章节：第一章为基于HIV-1RT的S-DABOs类抑制剂的研究；第二章为靶向于HIV-1gp120-SAP的多价态非等同双靶点抑制剂的研究；第三章分为基于分子片段设计的人类非洲锥虫病甲硫氨酰tRNA合成酶抑制剂的研究。第一章基于HIV-1RT的S-DABOs类抑制剂的研究：获得性免疫缺陷综合症俗称艾滋病(Acquried Immunodeficiency Syndrome)简称AIDS,是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)引起的严重传染性疾病,目前已经成为危害人类生命健康的重大传染性疾病。HIV是一种逆转录病毒,逆转录酶在病毒生命周期中的重要作用使其成为抗病毒治疗的重要靶点。逆转录酶抑制剂分为两类：核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂。非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)因具有高效、低毒、高选择性等特点而倍受关注。但是由于耐药毒株的蔓延使该类药物迅速丧失临床效价。因此新型、高效、低毒、广谱抗耐药的NNRTIs的研发是目前抗HIV药物研究的重要方向之一。至今已报道50多类NNRTIs,二氢烷氧苄基嘧啶酮(Dihydro-alkylthio-benzyl-oxopyrimidines, DABOs)衍生物为其中较为典型的一类,由于其结构的特点,DABO类非核苷类抑制剂能够提高分子构象的柔性及在靶点中的位置可适应性,有效的抑制靶点的突变,进而抑制耐药性的产生。结合计算机对接模型对抑制剂分子周围疏水、静电场,力场分析结果,本论文设计了新的2-(N-乙酰苯胺)取代S-DABO衍生物,通过变化母环5位、6位取代基来考察化合物的构型关系。为了从理论上验证设计思想的合理性,进行了对接分析,分析结果表明目标分子的结构修饰具有理论上的合理性。最后根据虚拟筛选的结果,从高到低打分,确定欲合成的目标化合物。通过对所合成的三个系列的DABOs化合物进行体外抗野生型HIV-1(ⅢB)、 HIV-2(ROD)及HIV-1突变毒株的细胞活性筛选以及对部分活性化合物进行HIV-1RT活性测试,结果显示大多数衍生物对HIV-1(ⅢB)具有较高的活性且具有较小的细胞毒性和较理想的选择性指数。活性最好的为4b6,EC5o为0.19±0.005μM,活性优于阳性对照药物NVP, DDC, DDI。在对HIV-1突变毒株的测试中,测试的化合物都保持了对HIV-1突变毒株E138K或Y181C的抑制活性。其中化合物4d6是抗耐药毒株活性最好的化合物,抗HIV-1E138K活性为1.05±0.24μM,耐突变指数为2.0,抗耐药性优于阳性对照药TMC125。4d6抗HIV-1Y181C活性为2.38±0.13μM,耐突变指数为4.5,抗耐药性优于阳性对照药PNU-90152T。HIV-1RT酶活性测试结果也进一步显示此系列的化合物作用靶点是HIV-1RT,此系列化合物属于非核苷类逆转录酶抑制剂。本研究通过合理的基于靶点的药物设计,发现了系列高活性的抗病毒谱广的S-DABOs类NNRTIs,具有进一步研究与开发价值。对抗HIV病毒药物的开发研究有着重大的意义。此外我们对所合成的S-DABO化合物进行了抗流感病毒体外细胞活性筛选,结果有惊喜发现。4个化合物4d2,4e2,4e3,4e4具有抗流感病毒活性。活性最好的化合物为4e4,同时具有抗流感病毒A(H1N1, H3N2)和抗流感病毒B的活性,抗流感病毒谱宽,而阳性对照药奥司他韦羧化物、金刚烷胺以及金刚乙胺只具有抗流感病毒A (H1N1, H3N2)的活性。4e4对流感病毒A(H1N1)的活性优于阳性对照药利巴韦林,金刚烷胺以及金刚乙胺,且4e4在对流感病毒B选择性上优于阳性对照药利巴韦林。目前化合物的作用靶点不明,但已排除化合物作用靶点为离子通道及神经氨酸酶的可能,其作用机制不同于已上市的离子通道类和神经氨酸酶药物。因此研究此类抑制剂对发现新的抗流感病毒药物作用靶点和寻找新的抗流感病毒药物作用机制及新的抗流感病毒"hit"药物具有重要意义。第二章靶向于HIV-1gp120-SAP的多价态非等同双靶点抑制剂的研究：在双靶点研究部分,本课题提出了基于双靶点蛋白晶体结构的模块设计来指导抑制剂设计的思想。先通过单独对某一个模块进行优化,再将其用于指导整体的双靶点抑制剂的设计,以得到低分子量、活性高的抑制剂,从而增大药物开发的成功率。以HIV-1病毒入侵过程中所依赖的细胞表面的靶点蛋白gp120为靶点,以人体血液中高含量的SAP为模板靶标来发挥其载体辅助作用,建立药物与双靶蛋白靶标相互作用的模块,经计算机虚拟筛选、定向合成以及抗HIV活性的筛选,期望获得具有高活性的靶向于gp120-SAP的非等同双靶点HIV抑制剂。目前已有结果证明SAP蛋白的存在对化合物的抑制活性具有协同作用,可部分证明我们设计思想的合理及可行性。第三章基于分子片段设计的人类非洲锥虫病甲硫氨酰tRNA成酶抑制剂的研究：人类非洲锥虫病严重威胁着人类的公共健康,在非洲撒哈拉南部肆虐。由于药物毒性、耐药性及现有药物作用的有限性,人类非洲锥虫病并没有得到很好的控制。因此研究新的高效、低毒、抗耐药性的药物成为目前治疗非洲锥虫病的首要任务。基于分子片段的药物设计已经逐渐发展成为一种重要的药物设计新方法。在本研究中,我们以布氏锥虫甲硫氨酰-tRNA合成酶为靶点,应用分子片段筛选方法—thermal shift(热熔法)对3000多个小分子片段(分子量<300)及化合物(分子量>300)进行与蛋白相互作用的筛选,筛选出一个活性片段2-氨基-8-羟基喹啉。将2-氨基-8-羟基喹啉作为热点化合物进行进一步的结构修饰及合成。合成了一系列新的具有2-氨基-8-羟基喹啉结构的双芳基二氨基类化合物。新的化合物进行了thermal shift,细胞及酶水平的抗锥虫病的活性研究。所有衍生物都对布鲁斯锥虫具有较高的活性,活性范围在7000-900nM。其中活性最好的为4b,EC50为900nM。选取了thermal shift活性最佳的化合物进行了抗甲硫氨酰-tRNA合成酶的活性测试,显示出了一定的甲硫氨酰-tRNA合成酶抑制活性,证明此系列的化合物作用于甲硫氨酰-tRNA合成酶。结合化合物在thermal shift测试中ATm有大的变化(ΔTms,9.5,8.6℃),也可以证明化合物作用的靶点为甲硫氨酰-tRNA合成酶。同时我们也进行了计算机分子模拟的研究。总之,我们应用基于分子片段的药物设计方法,应用thermal shift,发现了一类新的作用于甲硫氨酰-tRNA合成酶的结构骨架,具有进一步研究与开发价值。本研究也为发现新的安全有效的治疗人类非洲锥虫病的药物开辟了新的道路。

全文目录

中文摘要  10-13
ABSTRACT  13-17
符号说明  17-20
第一章基于HIV-1 RT的S-DABOS类抑制剂的研究  20-85
  第一节绪论  20-47
    1.1 引言  20-30
    1.2 HIV-1 NNRTI的作用机制及结构类型  30-38
    1.3 DABO类NNRTIs的研究进展  38-47
  第二节 S-DABO类HIV-1逆转录酶抑制剂目标化合物分子设计  47-54
    2.1 构效关系的研究  47-48
    2.2 目标化合物的设计  48-49
    2.3 分子对接模型及化合物库虚拟评价  49-54
      2.3.1 分子对接模型的建立  49-50
      2.3.2 虚拟筛选  50-54
  第三节实验部分  54-79
    3.1 仪器与试剂  54-55
    3.2 目标化合物的合成路线  55-56
    3.3 目标化合物的合成实验  56-68
      3.3.1 中间体的制备  56-58
      3.3.2 DABO系列目标化合物的制备及光谱解析  58-68
    3.4 化合物图谱特征峰归属与讨论  68-70
    3.5 目标化合物的抗HIV活性测定  70-79
      3.5.1 目标化合物抑制HIV活性试验  71-72
      3.5.2 活性结果初步分析  72-75
      3.5.3 抗HIV-1 RT活性测定  75-76
      3.5.4 构效关系分析  76-77
      3.5.5 分子模拟研究  77-79
  第四节 S-DABO类化合物的抗流感病毒活性评价  79-85
    4.1 流感病毒治疗现状  79-80
    4.2 抗流感病毒活性评价  80-84
      4.2.1 抗流感病毒体外细胞活性筛选试验  80-83
      4.2.2 流感病毒神经氨酸酶抑制活性评价  83-84
    4.3 小结  84-85
第二章靶向于HIV-1 GP120-SAP的多价态非等同双靶点抑制剂的研究  85-97
  第一节前言  85-88
    1.1 多靶点抑制剂的研究  85-87
    1.2 多价态非等同双靶点抑制剂的设计理论  87-88
  第二节 GP120-SAP的多价态双靶点抑制剂的设计  88-91
  第三节化合物合成及SAP蛋白的分离纯化  91-93
    3.1 化合物合成  91-92
    3.2 SAP蛋白的分离纯化及鉴定  92-93
  第四节细胞水平的活性筛选  93-96
    4.1 样品处理  93-94
    4.2 实验过程及结果  94-96
  第五节本章小结  96-97
第三章基于分子片段设计的人类非洲锥虫病甲硫氨酰TRNA合成酶抑制剂的研究  97-132
  第一节绪论  97-101
    1.1 药物研发现状  97
    1.2 基于分子片段药物发现方法  97-98
    1.3 基于分子片段药物发现流程  98-99
    1.4 基于分子片段的药物发现方法的应用  99-101
  第二节人类非洲锥虫病的研究现状  101-106
    2.1 人类非洲锥虫病的定义  101-102
    2.2 人类非洲锥虫病的感染和症状  102
    2.3 人类非洲锥虫病的治疗现状  102-103
    2.4 布氏锥虫氨酰-tRNA合成酶抑制剂的研究  103-106
  第三节应用THERMAL SHIFT对布鲁斯锥虫甲硫氨酰TRNA合成酶进行小分子片段筛选  106-115
    3.1 Thermal shift实验原理  106-109
    3.2 Thermal shift实验方法  109-112
    3.3 对布鲁斯锥虫甲硫氨酰tRNA合成酶的分子片段筛选结果  112-114
    3.4 小结  114-115
  第四节 2-氨基-8-羟基喹啉类衍生物的设计与合成  115-123
    4.1 蛋白与分子片段2-氨基-8-羟基喹啉的晶体结构解析  115
    4.2 2-氨基-8-羟基喹啉类衍生物的分子设计  115-117
    4.3 目标化合物的合成  117-123
  第五节 2-氨基-8-经基喹琳类衍生物抗布鲁斯锥虫旳活性测试及构效关系研究  123-131
    5.1 Thermal shift测试  123-125
    5.2 抗布鲁斯锥虫细胞水平活性测试  125-126
    5.3 抗布鲁斯锥虫MetRS酶水平活性测试(氨酰化实验)  126-127
    5.4 活性和构效关系总结  127-128
    5.5 分子对接研究  128-131
  第六节本章小结  131-132
第四章总结及展望  132-136
  1、目标分子的设计  132-133
  2、活性分子片段的筛选  133
  3、合成实验  133
  4、生物活性  133-135
  5、展望  135-136
参考文献  136-151
附录  151-207
  附录1 目标化合物的编号及结构  151-156
  附录2 化合物的~1H-NMR,IR和MS图谱  156-207
致谢  207-208
攻读博士研究生期间科研成果  208-209
学位论文评阅及答辩情况表  209

基于靶点结构的HIV-1抑制剂和基于分子片段设计的甲硫氨酰tRNA合成酶抑制剂的研究

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