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A型肉毒毒素轻链表达及其生物活性检测

作　者: 安佳佳
导　师: 张惟材
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 肉毒毒素 轻链 内肽酶 生物活性 检测方法
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


肉毒神经毒素(Botulinum neurotoxin, BoNT)是由厌氧的肉毒梭状芽孢杆菌产生的一种烈性蛋白毒素。肉毒毒素是目前已知毒性最强的蛋白毒素,被列入6种顶级生物恐怖剂之一,在民间误食肉毒毒素造成食物中毒的事件也时有发生,近年来肉毒毒素还被广泛用于美容及肌肉痉挛、腺体分泌过多等疾病的临床治疗。无论对于样品的侦检和产品的质控都亟需一套快速简便的方法,建立肉毒毒素快速、灵敏、可靠的生物活性检测方法对于生物反恐和医学检测都具有重要意义。肉毒毒素有7种血清型(A—G),各种毒素均由一条重链和一条轻链通过二硫键连接而成。重链N端能够结合特定胆碱能神经末梢质膜受体,C端主要在内化过程中起作用。而轻链是毒素的毒性成分,在重链的辅助下进入细胞,轻链能够穿过膜囊泡并且裂解胞质内的特定蛋白SNARE蛋白(可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性因子结合受体蛋白),阻断神经递质释放,导致肌肉松弛型瘫痪。其中,A型、E型和C1型的底物是突触小体相关蛋白SNAP25。目前,肉毒毒素检测的标准方法是小鼠急毒实验,但此方法周期长,步骤繁琐,需牺牲大量动物,数据波动大。因此,研究者一直在积极寻找一种可替代的方法。早期的检测方法主要基于毒素的抗原性,但这种方法仅能检测毒素的生物量,不能反映毒素的生物活性。近年来出现了一些基于轻链蛋白酶活性的检测方法。其中一类是荧光检测,另一类是检测底物的内部抗原。本课题旨在建立后一类基于底物内部抗原检测A型肉毒毒素生物活性的分析方法,其基本原理是利用A型肉毒毒素轻链蛋白能裂解底物SNAP251-206的Q197-R198特异位点,裂解后形成SNAP251-197(我们称为SNS蛋白),裂解后原先包埋于C端α螺旋内部的一个8肽抗原表位(SNAP25190-197)被暴露出来,通过检测此8肽的抗原性,可进行毒素蛋白酶活性的定性、定量测定。肉毒毒素毒性极强且来源受限,在实际操作中存在一定危险,而单独轻链和重链则不具毒性,我们尝试利用表达的A型肉毒毒素轻链进行内肽酶生物活性检测方法的建立。根据大肠杆菌密码子的偏好性,对A型肉毒毒素轻链全基因序列进行了优化和人工合成,并克隆至pTIG-Trx共表达质粒,实现了A型肉毒毒素轻链蛋白与硫氧化蛋白的高效共表达,其表达形式大部分为可溶蛋白,可溶蛋白占全菌蛋白的36.8%,表达量达294.4 mg/L。经纯化后蛋白纯度达99%以上,经SDS-PAGE及Western-blot鉴定对底物SNAP25蛋白具有良好的降解活性。毒素轻链的高效可溶表达目前在国内外还未见报道。利用RT-PCR的方法从小鼠脑组织中扩增得到A型肉毒毒素的底物突触小体相关蛋白SNAP25的基因,克隆至pTIG-Trx共表达质粒,实现了SNAP25蛋白与硫氧化蛋白的共表达,表达产物均为可溶蛋白,占全菌蛋白的26.2%,表达量达115.4 mg/L,经纯化后蛋白纯度达95%以上。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,SNAP25蛋白可被A型肉毒毒素轻链蛋白降解。采用pET28a表达质粒,克隆、表达并纯化了SNAP25的裂解产物SNS蛋白,其表达形式全部为可溶蛋白,表达蛋白占全菌蛋白的20.3%,表达量为203 mg/L,亲和纯化后纯度大于95%。经ELISA鉴定其具有良好的反应原性,冻干长期保存稳定性良好,可作为抗原参照蛋白进行BoNT/A体外生物活性的定量分析。合成了SNAP25190-197 8肽序列,将其交联至KLH(钥孔戚血蓝蛋白)上,于新西兰大耳白兔体内制备了其抗体,并经蛋白A亲和层析柱从抗血清中纯化获得了总IgG。经鉴定,此抗体检测灵敏度大于125 ng/mL,具有良好的灵敏度,符合检测抗体的条件。利用A型肉毒毒素轻链蛋白于体外建立了基于BoNT/A内肽酶活性的ELISA检测方法,并对该检测方法的条件进行了优化。底物最佳包被浓度确定为3μg/mL,检测样品反应时间为90 min,A型肉毒毒素轻链蛋白检测限为12 fg/mL,有效检测范围为0.023—24.0 pg/mL,检测方法的3组组内精密度CV均值分别为5.2%、5.4%、3.9%,组间精密度CV均值为6.3%,方法回收率介于92.6%—111.5%之间,考察了样品中可能存在的干扰物质(牛奶、血清、甘油等)对测定结果的影响,分析结果证明所考察的物质对测定结果均无显著影响,表明该方法快速、灵敏、稳定、可靠,可用于实际样品的检测。以BoNT/A轻链蛋白及SNS蛋白作为参照蛋白进行定量检测,考察了2种蛋白与BoNT/A LD50间的量效关系。通过软件对分析数据进行拟合可以得到检测响应值与剂量的函数关系。分析结果显示,1 LD50/mL BoNT/A相当于35.0 pmol的BoNT/A轻链蛋白或38.9 nmol的SNS。A型肉毒毒素检测限可达0.004 LD50 /mL,最佳检测范围为0.15—2.41 LD50/mL,方法回收率介于91.6%—112.9%之间,杂质加样回收率介于84.9%—135.4%之间。本文成功实现了A型肉毒毒素轻链的表达,并建立了一种A型肉毒毒素生物活性灵敏可靠的检测方法,该方法比目前已知的动物实验方法还要高出1-2个数量级,可满足A型肉毒毒素样品的定量检测需求,其检测原理还可望进一步推广至其他血清型肉毒毒素的检测。

全文目录


目录  4-7
英文缩略词表  7-8
摘要  8-10
Abstract  10-13
前言  13-17
第一章 BoNT/A 轻链高效表达、纯化及鉴定  17-27
  1 材料  17-19
    1.1 基因、质粒、菌株  17
    1.2 主要溶液  17-18
    1.3 主要试剂  18
    1.4 主要仪器  18-19
  2 方法  19-21
    2.1 表达质粒构建  19-20
    2.2 BoNT/A 轻链蛋白表达及表达产物分析  20-21
    2.3 BoNT/A 轻链蛋白纯化  21
    2.4 BoNT/A 轻链蛋白鉴定  21
  3 结果  21-24
    3.1 表达质粒构建  21-22
    3.2 BoNT/A 轻链表达  22-23
    3.3 BoNT/A 轻链亲和层析纯化  23
    3.4 BoNT/A 轻链生物活性  23-24
  4 讨论  24-25
  5 小结  25-27
第二章 SNAP25 蛋白表达、纯化及鉴定  27-35
  1 材料  27
    1.1 基因、质粒、菌株  27
    1.2 主要溶液  27
    1.3 主要试剂  27
    1.4 主要仪器  27
  2 方法  27-30
    2.1 表达质粒构建  27-29
    2.2 SNAP25 蛋白表达及表达产物分析  29
    2.3 SNAP25 蛋白纯化  29-30
    2.4 SNAP25 蛋白鉴定  30
  3 结果  30-33
    3.1 表达质粒构建  30-31
    3.2 SNAP25 蛋白表达  31
    3.3 SNAP25 蛋白纯化  31-32
    3.4 SNAP25 蛋白鉴定  32-33
  4 讨论  33
  5 小结  33-35
第三章 SNS 蛋白表达、纯化及鉴定  35-43
  1 材料  35
    1.1 基因、质粒、菌株  35
    1.2 主要溶液  35
    1.3 主要试剂  35
    1.4 主要仪器  35
  2 方法  35-38
    2.1 表达质粒构建  35-37
    2.2 SNS 蛋白表达及表达产物分析  37
    2.3 SNS 蛋白纯化  37
    2.4 SNS 蛋白反应原性鉴定  37-38
  3 结果  38-41
    3.1 表达质粒构建  38-39
    3.2 SNS 蛋白表达  39
    3.3 SNS 蛋白纯化  39-40
    3.4 SNS 蛋白的反应原性  40-41
  4 讨论  41
  5 小结  41-43
第四章 检测抗体制备  43-51
  1 材料  43-44
    1.1 制备抗原的相关材料  43
    1.2 主要试剂  43-44
    1.3 主要仪器  44
    1.4 实验动物  44
    1.5 说明  44
  2 方法  44-48
    2.1 抗血清效价检测方法  44-45
    2.2 多肽偶联KLH 载体蛋白  45
    2.3 抗血清制备  45-46
    2.4 IgG 的纯化  46-48
  3 结果  48-49
    3.1 抗血清的ELISA 检测  48-49
    3.2 抗血清的纯化  49
  4 讨论  49-50
  5 小结  50-51
第五章 A 型肉毒毒素生物活性检测方法的建立  51-75
  1 材料  51-52
    1.1 主要溶液  51
    1.2 主要试剂  51
    1.3 主要仪器  51
    1.4 实验动物  51-52
  2 方法  52-55
    2.1 底物最适包被浓度的确定  52
    2.2 样品反应时间的确定  52-53
    2.3 BoNT/A LC 检测限考察  53-54
    2.4 检测方法的精密度考察  54
    2.5 杂质对检测结果的影响  54
    2.6 BoNT/A 样品的检测  54-55
  3 结果  55-73
    3.1 底物最适包被浓度  55-56
    3.2 样品反应时间  56-57
    3.3 BoNT/A LC 检测限  57
    3.4 检测方法的精密度  57-62
    3.5 杂质对检测结果的影响  62-63
    3.6 BoNT/A 样品的检测  63-73
  4 讨论  73
  5 小结  73-75
结论  75-77
参考文献  77-81
个人简历  81-83
致谢  83

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物生物学
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