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β-聚苹果酸—聚乙二醇—叶酸纳米共聚物的合成及其性质研究

作　者: 陶阳春
导　师: 吴红
学　校: 第四军医大学
专　业: 药物化学
关键词: β-聚苹果酸叶酸纳米共聚物主动靶向药物载体
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

大部分抗肿瘤药物没有特异毒性，缺乏肿瘤选择性，并且部分肿瘤具有多药耐药性，这些因素导致了疗效的降低。为了使抗肿瘤药物最大程度地发挥疗效，抗肿瘤药物运载系统应运而生，在肿瘤靶向治疗方面占有重要地位并具有很好的应用前景。近几十年来，科研工作者们在聚合物药物运载系统的领域取得了很多成果，比如将脂质体，微球，纳米粒，胶束等运用于药物运载。药物转运系统可通过化学键合药物或者物理包封药物，提高了抗肿瘤药物的利用率，使其水溶性得到很大改善，体内半衰期延长。同时，可以在载体的表面修饰抗体或者配体达到主动靶向的效果。尽管很多药物运载系统表现出了相当好的肿瘤靶向性，通过抗原-抗体、受体-配体之间特异性结合将药物主动靶向至肿瘤细胞表面，但由于载体与靶细胞结合后入胞能力较弱，并不能提供足够高的胞内药物浓度，而细胞毒性药物必须进入细胞才能发挥作用，因而无法有效抑制肿瘤细胞的生长，特别是具有多药耐药性的肿瘤细胞；且载体在胞外释放的药物经过扩散后有可能重新分布到正常组织中，降低靶向药物的特异性。因此，生物活性分子的细胞内转运仍是药物转运中的一个关键问题。因此，除了构建主动靶向药物运转系统外，必须寻找一种能将药物高效介导进入细胞的方法，使更多的药物到达肿瘤部位后进入肿瘤细胞，提高药物的跨膜转运效率，真正达到肿瘤靶向给药的目的。细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPP），作为一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜作用不依赖经典的胞吞作用，具有细胞亲和性高、穿膜速度快、可迅速被降解的特点。其中，尤以转录激活蛋白（transcriptionalactivator protein，TAT）研究最为成熟。TAT是源自人免疫缺陷病毒Tat蛋白的一段碱性氨基酸多肽，能直接穿过细胞膜，迅速将与之连接的大分子转移到细胞内部。但是，TAT缺乏靶向特异性，对任何细胞具有相同的转导活性，甚至包括具有多药耐药性的肿瘤细胞。因此我们构想一种屏蔽/去屏蔽的方法来解决TAT缺乏特异性的问题，即TAT在到达靶向区域前被隐藏，避免TAT介导的非特异性穿膜；在到达靶向区域后，TAT完全暴露促进有效的细胞内化。在这一构想中，选用β-聚苹果酸为基材，在其主链上分别键合不同长度的PEG链和抗肿瘤药物。利用不同长度的PEG链同时运载配体、穿膜肽、生物素、单克隆抗体或靶向分子，使它们互不干扰。在肿瘤部位酸性环境下，依次发挥靶向累积及内化入胞作用。在正常体循环中（pH>7.2），短链PEG上的TAT隐蔽在长链PEG的保护层中；在肿瘤部位酸性环境中，靶向分子介导药物载体大量聚集于肿瘤细胞表面，连接长链PEG的酸敏部位迅速解离，穿膜肽暴露于载体表面，实现针对肿瘤细胞的高效内化。大量文献中报导靶向分子通过酰胺键或者酯键与药物载体键合,其在生理pH和肿瘤细胞外弱酸环境中的稳定性较好。为了实现这一构想，我们选用在弱酸环境中更易断裂的腙键作为酸敏部位，将β-聚苹果酸通过酸性敏感基团腙键键合带有靶向分子的α-羟基-ω-醛基聚乙二醇（长链PEG），以达到在肿瘤部位酸性环境长链PEG解离的效果。本研究中，采用经过水合肼修饰后带有酰肼键的β-聚苹果酸为纳米共聚物的主链，通过腙键键合醛基-聚乙二醇-叶酸（CHO-PEG-FA），制得β-聚苹果酸-聚乙二醇-叶酸（β-PMLA-PEG-FA）纳米共聚物，探讨该纳米共聚物中腙键在弱酸性环境中断键的特性。本研究为制备多功能β-聚苹果酸药物载体提供了重要的前期工作基础。1β-聚苹果酸的合成以L-天冬氨酸为原料合成β-烷氧羰基β-丙内酯，以其为单体，在引发剂的作用下进行开环聚合形成链状物，氢解去除苄基后得到β-PMLA。红外光谱和核磁共振图谱表征产物结构。2醛基-聚乙二醇-叶酸的制备定量称取叶酸和α-羟基-ω-醛基聚乙二醇溶于无水DMSO中，在EDC·HCl和DMAP的催化下反应。反应结束后透析除去未反应的小分子，冷冻干燥得到醛基聚乙二醇-叶酸。3带有酰肼键的β-聚苹果酸的制备定量称取PMLA和NHS溶于DMF中，室温下反应片刻。加入EDC·HCl，在其催化作用下冰浴反应。加入5%水合肼溶液，室温下反应。反应液用蒸馏水透析两天，冷冻干燥后得到带有酰肼键的β-聚苹果酸。4β-聚苹果酸-聚乙二醇-叶酸纳米共聚物的制备和表征定量称取醛基聚乙二醇-叶酸和带有酰肼键的β-聚苹果酸溶于DMF中，在EDC·HCl的催化下反应。反应液用蒸馏水透析两天，透析后的溶液冷冻干燥，得到β-聚苹果酸-聚乙二醇-叶酸。采用核磁共振表征该共聚物的结构。紫外分光光度法测定叶酸的含量为4.5wt%。5β-聚苹果酸-聚乙二醇-叶酸的体外腙键断裂研究动态透析法研究不同pH值叶酸的解离情况，即叶酸在不同pH缓冲液中的稳定性。释放出的叶酸浓度使用紫外分光光度计在波长280nm处测定。随着pH值的减小，叶酸的解离速度加快。在pH5.5、pH6.5及pH7.4的PBS缓冲体系中，6h后配体叶酸累积解离率分别为88.1%，85.3%和41.6%。6β-聚苹果酸-聚乙二醇-叶酸的细胞毒性研究以人肝癌SMCC-7721细胞为细胞模型，MTT法测定β-聚苹果酸-聚乙二醇-叶酸的细胞毒性。结果表明该共聚物没有细胞毒性，

全文目录

缩略语表  6-7
中文摘要  7-11
Abstract  11-15
前言  15-17
文献回顾  17-28
  1 肿瘤靶向  17-20
  2 药物转运系统（Drug Delivery Systems）  20-23
  3 β-聚苹果酸在药物运载系统领域的应用  23-25
  4 课题设想-功能化 β-聚苹果酸药物载体  25-28
实验一 β-聚苹果酸的合成  28-33
  1 材料和仪器  28
  2 实验方法  28-30
  3 结果与讨论  30-32
  4 小结  32-33
实验二 β-聚苹果酸-聚乙二醇-叶酸纳米共聚物的合成  33-39
  1 材料和仪器  33
  2 实验方法  33-34
  3 结果与讨论  34-38
  4 小结  38-39
实验三 β-聚苹果酸-聚乙二醇-叶酸纳米共聚物的性质研究  39-43
  1 材料和仪器  39
  2 实验方法  39-40
  3 结果与讨论  40-42
  4 小结  42-43
小结  43-45
参考文献  45-51
个人简历和研究成果  51-52
致谢  52

β-聚苹果酸—聚乙二醇—叶酸纳米共聚物的合成及其性质研究

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