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泛素化对多器官功能障碍综合征脾脏树突状细胞功能的调节作用与机制研究

作　者: 李菲
导　师: 陆江阳
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 多器官功能障碍综合征 脾脏 树突状细胞 主要组织相容性复合体-Ⅱ 泛素-蛋白酶体途径 MARCH1
分类号: R459.7
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：研究多器官功能障碍综合征（multiple organs dysfunction syndrome，MODS）病程中脾脏树突状细胞（dendritic cells，DC）的变化及MHC-Ⅱ蛋白的泛素依赖性作用，证实泛素-蛋白酶体途径在MODS病程中对脾脏DC MHC-Ⅱ变化及DC功能的影响，探讨E3泛素连接酶MARCH1在MODS第一次打击期对脾脏DC MHC-Ⅱ泛素化调节的作用机制，并观察干预MARCH1对MODS第一次打击期脾脏DC免疫功能的影响，进而为MODS的免疫调节与防治寻找新的靶点。方法：采用腹腔注射酵母多糖复制MODS小鼠模型。120只小鼠随机分为正常对照组和MODS1d、3d、5d、7d和10d组。各组实验小鼠分别分离脾脏和胸腺组织，一部分脾脏应用免疫荧光方法检测CD11c+DC数量的变化，剩余组织应用MiniMACS免疫磁珠分别分离DC和T细胞用于体外细胞学实验。运用流式细胞术、Real-Time PCR、Western Blot和MTT法等检测DC对CD86、MHC-Ⅱ、泛素、E3泛素连接酶（MARCH1-8）的表达，DC分泌IL-12、TNF-α的水平以及诱导T细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ的水平。接着运用免疫共沉淀及WesternBlot检测正常对照组和MODS1d组DC MHC-Ⅱ蛋白泛素化水平，并用MG132分别处理两组DC各6h，运用PI染色法、Real-Time PCR、Western Blot和MTT法等检测处理前后各组DC的凋亡率，DC对MHC-Ⅱ蛋白的表达以及诱导T细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平。通过从小鼠尾部提取cDNA作为模板，采用特异的引物，运用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增出MARCH1cDNA片段，EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，连接于载体pMB-HA质粒上，构建pMB-HA-MARCH1重组载体，经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果，转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化。将pMB-HA-MARCH1表达载体和SiRNA分别转染进MODS1d组DC，运用MTT法、PI染色法、流式细胞术、Real-Time PCR、免疫共沉淀及Western Blot等比较MODS1d组、MARCH1siRNA敲低组和MARCH1过表达组DC的形态、活力和凋亡率，DC对MHC-Ⅱ蛋白的表达和泛素化水平以及诱导T细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平。结果：MODS病程中CD11c+DC数量逐渐减少，DC表面MHC-Ⅱ和CD86蛋白，DC分泌的IL-12、TNF-α和其介导的T细胞增殖活性以及T细胞分泌的IL-2和IFN-γ的表达均为先升高，在MODS1d组达到峰值，此后下降，至MODS期降到最低点，但MHC-Ⅱ和泛素的mRNA水平变化均不明显。而E3泛素连接酶中MARCH1的变化最显著，mRNA和蛋白水平表达均为先下降，在MODS1d组达到最低值，后略有升高趋势，直至MODS10d组又有所下降。在MODS病程中MHC-Ⅱ与MARCH1的变化趋势大致相反。MODS1d组脾脏DC MHC-Ⅱ蛋白泛素化程度较正常对照组显著降低，MG132处理前后两组DC凋亡率无明显变化，而DC MHC-Ⅱ蛋白的表达以及诱导T细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平均为MODS1d组与MG132处理后的正常对照组比正常对照组高，其中前者比后者稍高，MG132处理后的MODS1d组为最高。成功构建了E3泛素连接酶MARCH1的真核表达载体pMB-HA-MARCH1，并合成了3条效果比较理想的MARCH1的siRNA。对MODS1d组DC进行MARCH1过表达和siRNA敲低干预，发现三组DC的形态、活力和凋亡率均无明显变化，而MARCH1过表达干预可以增加MHC-Ⅱ的泛素化程度，减少MHC-Ⅱ的蛋白表达水平，并降低DC诱导T细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的功能；而MARCH1siRNA敲低干预则相反可以降低MHC-Ⅱ的泛素化程度，增加MHC-Ⅱ的蛋白表达水平，并增强DC诱导T细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的功能。结论：1、在MODS第一次打击期DC的数量虽有下降，但其抗原提呈功能与激活T细胞介导免疫应答反应的能力却是增强的；而到了MODS期，DC的数量及功能均降至最低，机体处于免疫抑制状态。2、在MODS病程中，是MARCH1通过泛素化降解MHC-Ⅱ减少了小鼠脾脏DC MHC-Ⅱ的表达。3、在MODS中脾脏DC MHC-Ⅱ的变化确实是具有泛素依赖性。4、成功构建了E3泛素连接酶MARCH1的真核表达载体pMB-HA-MARCH1，并合成了3条效果较理想的MARCH1的siRNA。5、在MODS病程第一次打击期，脾脏DC MHC-Ⅱ过表达的原因与MARCH1对MHC-Ⅱ的泛素化降解程度较低有关。提示病程初期用MARCH1过表达干预，可以作为防止MODS免疫机能过亢和炎症反应过度的一个潜在的治疗靶点。

全文目录


缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-15
材料与方法  15-37
  一、实验材料  15-17
    1、实验试剂与药品  15-16
    2、实验仪器  16-17
  二、实验动物模型与分组  17-18
    1、实验动物模型  17-18
    2、实验分组  18
  三、标本采集与处理  18
  四、实验方法  18-35
    1、脾脏组织 HE 染色光镜观察  18-19
    2、脾脏组织免疫荧光染色标记 CD11c+DC 数量  19
    3、小鼠脾脏 DC 的分离与提取  19-21
    4、小鼠胸腺 T 淋巴细胞的分离与提取  21
    5、流式细胞术检测分离细胞纯度及 DC 凋亡率和表面 CD86、MHC-Ⅱ  21-22
    6、Real-Time PCR 检测各种因子 mRNA 水平的表达  22-26
    7、Western Blot 检测 MHC-Ⅱ和 MARCH1 蛋白的表达  26-29
    8、免疫共沉淀检测 MHC-Ⅱ蛋白的泛素化水平  29
    9、pMB-HA-MARCH1 真核表达载体的构建  29-34
    10、pMB-HA-MARCH1 真核表达载体和 SiRNA 的脂质体转染进 DC  34
    11、Annexin-V/PI 双标记染色法检测 DC 凋亡率  34
    12、MTT 法检测 T 细胞增殖活性  34-35
  五、统计学分析  35-37
结果  37-87
  第一部分：小鼠 MODS 病程中脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白的泛素相关性研究  37-63
    一、MODS 病程中小鼠生理体征的变化  37-38
    二、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 的变化  38-52
      1、MODS 病程中小鼠脾脏组织病理学的变化  38-39
      2、MODS 病程中小鼠脾脏 CD11c+DC 数量的变化  39-41
      3、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 表面分子和分泌因子的变化  41-49
      4、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 对 T 细胞功能影响的变化  49-52
    三、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 泛素和 E3 泛素连接酶表达的变化  52-63
      1、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 泛素 mRNA 表达的变化  52-53
      2、MODS 病程中小鼠脾脏 DC E3 泛素连接酶（MARCH1-8）mRNA 表达的变化  53-61
      3、MODS 病程中小鼠脾脏 DC MARCH1 蛋白表达的变化  61-63
      4、MODS 病程中 MARCH1 与 MHC-Ⅱ蛋白表达的比较  63
  第二部分：脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白泛素化的分子机制及干预研究  63-87
    一、MODS 1d 组 DC MHC-Ⅱ蛋白水平变化的泛素依赖性  63-71
      1、MODS 1d 组 DC MHC-Ⅱ蛋白泛素化水平的变化  63-64
      2、正常对照组及 MODS 1d 组 DC 经 MG132 处理前后 MHC-Ⅱ的变化  64-68
      3、正常对照组及 MODS 1d 组 DC 经 MG132 处理前后对 T 细胞影响的变化  68-71
    二、pMB-HA-MARCH1 真核表达载体和 MARCH1 siRNA 的构建  71-75
      1、pMB-HA-MARCH1 真核表达载体的构建  71-74
      2、MARCH1 siRNA 的构建  74-75
    三、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组 MHC-Ⅱ及 DC 免疫功能影响的变化  75-87
      1、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组 DC 基本生理状况影响的变化  75-78
      2、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组 DC MHC-Ⅱ影响的变化  78-82
      3、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组 DC 对 T 细胞功能影响的变化  82-87
讨论  87-99
  一、小鼠 MODS 模型中脾脏 DC 的变化与意义  87-90
    1、关于小鼠 MODS 模型的应用与评价  87-88
    2、MODS 病程中脾脏 DC 分化、成熟及免疫功能的变化与意义  88-90
  二、MODS 中脾脏 DC MHC-Ⅱ的变化规律  90
  三、在 MODS 病程中泛素-蛋白酶体途径对脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白水平变化的影响作用  90-94
    1、MODS 病程中脾脏 DC 泛素 mRNA 水平表达的变化规律  91
    2、MODS 病程中脾脏 DC E3 泛素连接酶 mRNA 和蛋白水平表达的变化规律  91-93
    3、MODS 病程中 MARCH1 与 MHC-Ⅱ蛋白表达的比较  93-94
  四、MODS 第一次打击期脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白水平变化的分子机制探讨及干预效应  94-99
    1、MODS 1d 组脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白泛素化水平的变化  94
    2、MODS 1d 组脾脏 DC MHC-Ⅱ泛素化降解途径的分子效应  94-95
    3、关于 pMB-HA-MARCH1 真核表达载体和 MARCH1 siRNA 的构建与应用  95-96
    4、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白水平及泛素化程度的影响  96-97
    5、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组脾脏 DC 免疫功能的影响  97-99
结论  99-101
参考文献  101-109
综述  109-113
个人简历  113-115
致谢  115

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 治疗学 > 急症、急救处理
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