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HMME-PDT对牙菌斑生物膜活性及结构的影响

作　者: 常秀明
导　师: 邹朝晖
学　校: 天津医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 光动力疗法龋病菌斑生物膜单线态氧激光共聚焦显微镜
分类号: R781.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：龋病是一种发生于牙体硬组织的由口腔常在菌引起的内源性感染性疾病,在各种疾病的发病率中,龋病位居前列。我国第三次全国口腔健康流行病学抽样调查结果显示,现在最突出的口腔健康问题表现在龋齿上：5岁儿童乳牙龋齿的患病率为66%,35～44岁中年人龋齿患病率为88.1%,65～74岁老年人龋齿患病率高达98.4%。不仅如此,龋病及其并发的牙髓病和根尖周病是口腔科就诊率最高的病种。鉴于龋病的常见性和多发性,龋病预防的意义远远大于被动治疗。龋病发生、发展的过程只有依靠牙菌斑才能介导和完成。因此,通过适当的方法影响牙菌斑生物膜内细菌的生长代谢,干扰牙菌斑形成或促使牙菌斑解离,即可达到预防龋病的目的。本实验首先通过应用波长532nm的半导体激光器和光敏剂血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethylether, HMME)对四种主要致龋菌混合菌悬液进行光动力治疗,探讨光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)对致龋菌是否具有杀灭作用,并筛选出PDT的最佳效应参数；体外建立混合菌菌斑生物膜进行光动力实验,探讨PDT对菌斑生物膜结构、细菌活性和产酸能力的影响,并验证单线态氧在HMME-PDT杀菌过程中的作用。方法：1.变形链球菌、血链球菌、嗜酸性乳杆菌和粘性放线菌分别于37℃厌氧环境中培养48h复苏,制备成1×108CFU/mL的混合菌悬液备用。2.混合菌悬液分别与浓度为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml的HMME37℃黑暗中孵育5分钟后,应用波长532nm半导体激光器照射30s、60s、90s、120s,处理完毕进行菌落计数,与对照组进行比较,选择PDT最佳效应的实验参数,为下一步的菌斑生物膜模型实验提供依据3.体外环境下,选择四种口腔主要致龋菌在牙釉质表面形成混合菌菌斑生物膜。实验分为5组：HMME-PDT组、HMME-PDT加叠氮钠组、单纯叠氮钠处理组、阳性对照西吡氯铵处理组、阴性对照生理盐水处理组。根据平板落计数和24小时内PH值测定结果观察HMME-PDT对菌斑生物膜内细菌活性和产酸能力的影响。通过激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scan Microscope, CLSM)观察HMME-PDT对菌斑生物膜结构的影响。结果：1.混合菌菌悬液实验平板菌落计数结果显示,在本实验条件下,HMME-PDT对致龋菌最佳效应的实验参数为：光敏剂HMME浓度40μg/ml,波长532nm、功率密度0.14W/cm2半导体激光器连续照射90s。2.根据HMME-PDT对混合菌菌斑生物膜中细菌作用的平板菌落计数结果显示：与阴性对照生理盐水处理组相比,单纯叠氮钠组对混合菌菌斑生物膜中细菌的生长几乎没有影响(P>0.05)；西吡氯铵处理组可使混合菌菌斑生物膜内细菌数量减少(P<0.05),杀菌率为51.86%；而HMME-PDT组可使混合菌菌斑生物膜内细菌的数量显著减少(P<0.05),杀菌率高达94.92%；HMME-PDT+叠氮钠组对混合菌菌斑生物膜中细菌的杀灭作用不明显(P>0.05),杀菌率仅为9.47%。3.由24小时内不同时间点不同处理组上清液的pH值结果可以看出,与生理盐水处理组相比,HMME-PDT及西吡氯铵处理均可使混合菌菌斑生物膜内细菌产酸能力显著降低,其⊿pH (pH的变化幅度)明显减小(P<0.05)；HMME-PDT组与西吡氯铵处理组相比仍有显著性差异(P<0.05),且在HMME-PDT处理24h后培养物上清的pH值为6.01,高于致龋临界pH值(5.0～5.5)；HMME-PDT+叠氮钠组和单纯叠氮钠处理组对生物膜内细菌代谢产酸没有显著影响,⊿pH值无统计学意义(P>0.05)。4.CLSM断层扫描图像显示：生理盐水处理组菌斑生物膜底层和表层细菌较少、较稀疏；中间层细菌明显增多,密集,层叠如棉絮状；三维重建图像可见生物膜结构致密,有一定厚度,中间有许多暗黑的管道系统。HMME-PDT处理后的菌斑生物膜底层和表层几乎无细菌存在；中间层有少许细菌存活,细菌之间间隙较大,呈星点样散布；菌斑生物膜整体结构稀疏分散,未形成典型的三维立体结构。结论：1.HMME-PDT对混合菌菌悬液有明显的杀伤作用,杀伤效果与光敏剂浓度、激光照射时间有着密切的关系。2.HMME-PDT可以明显降低菌斑生物膜中细菌的活性并抑制其代谢产酸。3.单线态氧在HMME-PDT杀菌过程中起着极其重要的作用。4.HMME-PDT可以破坏菌斑生物膜结构的完整性,促进其解离。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
缩略语/符号说明  11-12
前言  12-15
  研究现状、成果  12-13
  研究目的、方法  13-15
一、HMME-PDT对混合菌菌液杀伤作用的研究  15-22
  1.1 对象和方法  15-17
    1.1.1 实验菌株及主要试剂  15
    1.1.2 主要仪器  15
    1.1.3 菌悬液的制备  15
    1.1.4 TPY琼脂培养基的配制  15-16
    1.1.5 光敏剂的制备  16
    1.1.6 PDT的处理过程和实验分组  16
    1.1.7 菌落计数  16
    1.1.8 统计学分析  16-17
  1.2 结果  17-18
  1.3 讨论  18-20
  1.4 小结  20-22
二、HMME-PDT对牙菌斑生物膜内致龋菌的影响及作用机制的研究  22-29
  2.1 材料与方法  22-24
    2.1.1 实验菌株  22
    2.1.2 主要试剂  22
    2.1.3 主要仪器  22
    2.1.4 釉质块的制备及人工获得性膜的形成  22-23
    2.1.5 混合菌菌斑生物膜的形成  23
    2.1.6 实验分组  23
    2.1.7 PDT对混合菌菌斑生物膜内细菌活力的影响  23
    2.1.8 PDT对混合菌菌斑生物膜内细菌代谢产酸的影响  23-24
  2.2 结果  24-26
    2.2.1 各组之间菌落计数的比较  24-25
    2.2.2 pH值记录  25-26
  2.3 讨论  26-28
  2.4 小结  28-29
三、HMME-PDT对牙菌斑生物膜结构的影响  29-35
  3.1 对象和方法  29
    3.1.1 实验菌株  29
    3.1.2 材料与仪器  29
    3.1.3 混合菌菌斑生物膜的形成  29
    3.1.4 实验分组  29
    3.1.5 激光共聚焦显微镜观察PDT对混合菌菌斑生物膜结构影响  29
  3.2 结果  29-32
  3.3 讨论  32-34
  3.4 小结  34-35
结论  35-36
参考文献  36-41
发表论文和参加科研情况说明  41-42
综述  42-58
  综述参考文献  52-58
致谢  58

HMME-PDT对牙菌斑生物膜活性及结构的影响

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