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原发性肝癌是常见的恶性肿瘤,每年约有50万人被诊断出肝癌,在西方发达国家发病率在10?20/10万,而在亚洲、非洲一些发展中国家发病率则超过20/10万,且发病率逐年上升[1]。肝癌发病隐匿、早期无症状或症状不明显,待发现病情时多为肝癌晚期。目前,血清AFP检测是筛选肝癌的基本手段之一[2]。然而,这种方法的敏感度不高,对于直径小于3 cm的小肝癌,AFP检测的敏感度在26. 9 %?39. 3 %之间[3, 4],对于直径更小的小肝癌( < 2cm),其敏感度仅为17 %?42 %。因此,要提高肝癌的早期诊断率还需要新的肝癌标志物。近些年,寻找新的肝癌检测标志物或治疗靶分子一直是肝癌研究的热点。2003年,韩国学者Ko等[5]通过差异显示RT-PCR法首次发现人宫颈癌基因(Human Cervical Cancer Oncogene,HCCR)。HCCR有HCCR-1和HCCR-2两个亚型。前者只是比后者多外显子1,其余序列完全一致。后续研究表明HCCR不仅仅在宫颈癌组织中表达,在人多种肿瘤中均有高表达,提示癌基因HCCR与多种肿瘤的发生、发展有关。Yoon等[6]发现HCCR蛋白在肝癌组织细胞呈强阳性,在肝硬化组织细胞中呈弱阳性,而在正常组织细胞中则为阴性,对原发性肝细胞癌的诊断准确率远远超过甲胎蛋白,其敏感性达到78.2%,特异性为95.7%。在小肝癌( < 2cm)检测方面,HCCR阳性检率为69. 2 %,显著高于AFP的46. 2 %。所以,本实验希望能够制备出特异性好,灵敏度高的HCCR单克隆抗体,进而建立一种新的肝癌血清检测方法,提高肝癌检测特别是小肝癌检测的灵敏度及准确率。HCCR蛋白是一种Ⅱ型跨膜蛋白,其HCCR-1蛋白C末端的167-360aa暴露在胞外区,当发生肝癌时,该蛋白片段被切割并释放到血液中[7],所以,我们选择HCCR-1167-360作为制备抗体的抗原。首先,从HepG2细胞中获得HCCR-1167-360的编码序列,将该编码序列与表达载体pET-28a重组,其N端含有His标签,可用于后续蛋白纯化。通过IPTG诱导表达,成功获得了HCCR-1167-360重组蛋白。但由于表达的蛋白以包涵体形式存在,难于复性及纯化,导致无法用于动物免疫,最终我们将HCCR-1167-360蛋白进行SDS-PAGE电泳,显色后将含蛋白的胶块切下研磨,研磨均匀后不加佐剂直接用于免疫小鼠,免疫三次后小鼠血清抗体效价达到1:10000以上,这说明,用含有重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶也可免疫动物制备抗体。由于位于聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质处于变性状态,所以,以这种蛋白质免疫得到的抗体可能主要是识别抗原线性表位的抗体。为此,在筛选抗体的时候首先选择HCCR-1蛋白的一个线性表位,C末端355-360aa(YLGTRR)[6, 8],构建Ep-HCCR表达载体,纯化的Ep-HCCR0蛋白用于血清抗体效价检测及阳性克隆筛选。采用PEG-1500诱导小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞的融合,利用纯化的Ep-HCCR蛋白筛选,经4次亚克隆后,最终获得1株分泌HCCR抗体的杂交瘤细胞。采用Sigma IsoQ5试纸条检测表明,HCCR抗体IgG1亚类抗体。通过ELISA、Western Blot、免疫荧光及免疫组化等方法对抗体性质进行鉴定。ELISA结果表明,该抗体只识别Ep-HCCR蛋白,与其他杂蛋白无交叉反应;抗体灵敏度较好,检测极限达到10ng/ml;腹水抗体效价达到1:10000以上。采用间接ELISA方法测定抗体的亲和力,根据公式Kaff=(n-1)/2(n[Ab?]t?[Ab]t),最终计算出该抗体亲和常数Kaff=5.4×106L/mol。通过Western Blot方法检测几种肝癌细胞系及不同肿瘤细胞系中HCCR蛋白表达情况。在肝癌细胞系HepG2、BEL-7402、7721、BEL-7404中,HCCR蛋白高表达,在正常肝细胞L02中未见表达;在结肠癌细胞Lovo、淋巴瘤细胞Raji、乳腺癌细胞MCF-7及宫颈癌细胞Hela中均发现有HCCR蛋白表达,但表达量差异较大,在卵巢癌细胞OV3中未见其表达,这表明,HCCR蛋白并非肝癌特异性表达蛋白,可能与多种肿瘤的发生发展有关。免疫荧光显示,该抗体能够识别HepG2细胞胞膜和胞质中的HCCR蛋白,HCCR蛋白定位与文献报道[6]一致,说明我们制备的HCCR抗体能够识别天然状态下的蛋白。免疫组化显示,HCCR抗体能够检测到肝癌患者组织中HCCR蛋白表达,而在正常肝组织中未发现HCCR蛋白存在。建立了检测血清HCCR的ELISA方法。收集了121例肝癌患者血清和20例正常人血清,利用ELISA方法检测血清中HCCR蛋白表达情况。结果显示,在121例肝癌患者血清中,HCCR阳性率达到71.07%(86/121),显著高于AFP的59.50%(72/121),两者联合检测阳性率高达86.78%(105/121);在62例伴有HCV/HBV感染的肝癌患者中,HCCR阳性率为70.97%(44/62),高于AFP的62.9%(39/62),两者联合检测检出率为90.33%(56/62);在HCV/HBV感染和未感染患者中,HCCR阳性率分别为70.97%和71.17%,说明HCCR表达与HCV/HBV病感染无相关性;HCCR在肝癌早中期(Ⅰ、Ⅱ级)和晚期(Ⅲ、Ⅳ级)检出率分别为71.08%(59/83)和71.05%(27/38),说明HCCR蛋白表达量与肝癌临床分级无关;将患者血清分别置于4℃和常温,48h后检测,结果差异性不显著,说明HCCR蛋白在血清中性质相对稳定。此外,我们还利用本室制备的GP73抗体检测肝癌血清中GP73表达情况,结果显示,GP73阳性率为80.99%,它与AFP、HCCR联合检测阳性率高达97.51%,三者显示出了良好的互补性。总之,我们通过聚丙烯酰胺凝胶免疫动物,最终获得了1株分泌HCCR抗体的杂交瘤,该抗体可用于ELISA、Western Blot、免疫荧光及免疫组化等方法分析,能有效识别细胞和组织中表达的HCCR蛋白;在肝癌血清检测中,检出率高于AFP,且与AFP、GP73有良好的互补性,这为下一步检测试剂盒的研制奠定了较好的基础。
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