学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

Gankyrin促进结直肠癌肝转移的机制研究

作　者: 柏兆方
导　师: 张学敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: 结直肠癌肿瘤转移 Gankyirn Interleukin8 Cyclin D1
分类号: R735.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 48次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

结直肠癌被广泛认为是一种致死率极高的癌症。死亡率高的一个重要原因是其发生肝转移。在结直肠癌患者中25%的病人被诊断为发生肝转移，而另外25%的患者在早期诊断中并未发现转移灶，但是之后发展为肝转移。目前化疗药物对肝转移的治疗效果十分有限。随着对结直肠癌肝转移研究的深入，已经有一些信号分子成为结直肠癌肝转移药物研发的潜在靶标。Gankyrin又名PSMD10、 p28gank和nas6，是近年新发现的原癌基因。Gankyrin是26S蛋白酶复合体p28亚基的组成成分。该蛋白包含7个锚蛋白(ankyrin)重复序列，这些重复序列主要功能是负责蛋白之间的相互作用。目前Gankyrin属于原癌基因已经被诸多证据证实，首先Gankyrin可以降解Rb,引起Rb去磷酸化失活，导致E2F转录因子活化，引起细胞周期S期到G1其相关基因的表达，促进细胞分裂和生长，导致肿瘤的发生。过表达Gankyrin还可引起NIH3T3细胞的恶性转化。另外，Gankyrin通过泛素化途径引起p53蛋白泛素化降解，使得p53这一重要的抑癌基因功能缺失，导致肿瘤发生。Gankyrin与这些重要的肿瘤相关的分子相互作用，例如Rb、p53、MDM2等，进而在细胞周期、细胞凋亡和转化等肿瘤相关生物学事件中发挥重要的作用。文献报道在肝癌等肿瘤组织中Gankyrin的mRNA上调以及蛋白质水平高表达。我们通过大量结直肠癌临床样本分析发现，Gankyrin在结直肠癌中高表达并具有显著的统计学意义。更重要的是，我们发现Gankyrin的表达水平与结直肠癌肝转移的发生也存在显著相关性。尽管Gankyrin作为原癌基因，在促进肿瘤的转移上已经有相关报道，但是其具体促进肿瘤转移机制目前却知之甚少。为进一步研究Gankyrin在结直肠癌转移中的作用，本课题组对48例发生肝转移的原位结直肠癌临床样本和33例未发生肝转移的结直肠癌临床样本进行了分析，结果发现在发生肝转移的组织样本中Gankyrin的表达显著增加。同时对Gankyrin的亚细胞分布进行了统计学分析，结果发现发生肝转移的结直肠癌细胞中Gankyrin核内表达显著增加。随后我们对Gankyrin在结肠癌中的作用进行了研究，首先我们验证了Gankyrin促肿瘤细胞的增殖能力和转化能力，小鼠成瘤实验也证明Gankyrin能促进肿瘤生长。为进一步研究Gankyrin在结直肠癌肝转移中的作用和机制，我们通过体内和体外实验证明了Gankyrin促结直肠癌细胞迁移和促结直肠癌转移浸润的能力。首先利用Transwell等实验评价了干涉Gankyrin的结肠细胞迁移能力，结果表明干涉Gankyrin后细胞的迁移能力显著降低，这说明Gankyrin促进结直肠癌细胞的迁移。同时本课题组成员经过Time-lapse实验和浸润实验等也进一步证明Gankyrin促进结直肠癌细胞的迁移和浸润。为进一步验证Gankyrin是否在体内同样促进结直肠癌的转移，我采用小鼠脾注射肝转移模型评价干涉Gankyrin的SW480细胞转移能力的变化，我们发现干涉Gankyrin后细胞形成的脾脏原位肿瘤肝转移能力明显降低。但是由于我们选用的是免疫缺陷的小鼠，为排除免疫系统对转移的影响，我们又利用两种鼠源性结直肠癌细胞在健全免疫系统的小鼠上评价了Gankyrin对肿瘤转移的影响。结果同样发现，干涉Gankyrin后细胞形成的脾脏原位肿瘤肝转移能力显著降低。这也充分说明Gankyrin促进了结直肠癌的转移。为进一步研究Gankyrin的促转移机制，我对本实验室开展的干涉Gankyrin的SW480细胞基因表达谱数据进行了进一步分析。经过分析我们发现Gankyrin调控的基因主要包含在IL-8信号通路、AMPK信号通路、PI3K/AKT信号通路等。其中IL-8信号通路中的IL-8和Cyclin D1可以促进结直肠癌的转移。本课题组通过临床样本分析，发现IL-8信号通路中两个重要蛋白，IL-8和Cyclin D1与Gankyrin的表达存在显著的相关性。ELISA和Western blot实验分析也证明Gankyrin上调IL-8和Cyclin D1的表达。为进一步验证IL-8和Cyclin D1是否为Gankyrin促结直肠癌肝转移的下游效应分子，我们选用敲除Ccnd1基因的3T3细胞，通过Transwell实验证明Gankyrin促肿瘤转移需要Cyclin D1的参与，同样我们利用干涉Gankyrin的SW480细胞，通过Transwell实验也证明IL-8是Gankyrin促转移的下游靶基因。上述实验结果证明IL-8信号通路在Gankyrin促肿瘤转移中发挥重要作用。我们的研究表明Gankyrin通过上调IL-8信号通路促进结直肠癌的肝转移。Gankyrin作为促进结直肠癌生长和转移的重要基因，可以作为潜在的结直肠癌诊断和治疗的靶点，在临床诊断和治疗中发挥作用。

全文目录

缩略词表  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-13
材料与方法  13-26
  1 材料及来源  13-14
    1.1 菌株和质粒  13
    1.2 实验动物  13
    1.3 主要试剂  13
    1.4 主要仪器设备  13
    1.5 细胞培养和转染  13-14
  2. 实验方法  14-26
    2.1 分子克隆  14
    2.2 重组慢病毒的包装和感染  14-15
    2.3 靶细胞的感染  15
    2.4 免疫组织化学染色  15-17
    2.5 Western blot  17
    2.6 细胞增殖实验  17-18
    2.7 软琼脂克隆形成实验  18
    2.8 裸鼠成瘤实验  18-19
    2.9 C57BL/6 小鼠成瘤实验  19
    2.10 细胞迁移实验  19-20
    2.11 人和鼠源的结直肠癌细胞的脾注射肝转移小鼠模型  20-22
    2.12 Real time PCR 验证芯片结果  22-23
    2.13 ELISA 实验  23-24
    2.14 IL-8 对 SW480-shControl 和 SW480-shGankyrin 细胞迁移影响的实验  24-26
结果  26-41
  1. Gankyrin 促进结直肠癌细胞的生长  26-27
  2. Gankyrin 增强结直肠癌细胞的转化能力  27-28
  3. Gankyrin 增强结直肠癌细胞的成瘤能力  28-30
  4. Gankyrin 促进结直肠癌细胞的迁移  30-32
    4.1. Seeding stopper 实验评价 Gankyrin 促进结直肠癌细胞迁移  30-31
    4.2. Transwell 实验评价 Gankyrin 促进结直肠癌细胞 SW480 迁移  31-32
  5. Gankyrin 对小鼠结直肠癌肝转移的影响  32-35
    5.1. SW480-shGankyrin 细胞在小鼠肝转移模型中的转移能力降低  32-33
    5.2. MC38-shGankyrin 细胞在小鼠肝转移模型中转移能力降低  33-34
    5.3. CT26-shGankyrin 细胞在小鼠肝转移模型中转移能力降低  34-35
  6. 基因芯片分析 Gankyrin 调控的基因  35-36
  7. Gankyrin 上调 IL-8 促进结直肠癌的转移  36-38
  8. IL-8 部分逆转了干涉 Gankyrin 对细胞迁移的抑制效应  38-39
  9. Gankyrin 通过上调 Cyclin D1 促进结直肠癌转移  39-41
讨论  41-45
总结  45-46
参考文献  46-49
文献综述  49-56
  参考文献  52-56
个人简历  56-58
致谢  58-59

Gankyrin促进结直肠癌肝转移的机制研究

内容摘要

全文目录

相似论文