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CUEDC2在结肠炎相关肿瘤中作用机制的研究

作　者: 王少鑫
导　师: 张学敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: 结肠炎相关肿瘤 AOM/DSS模型 CUEDC2 细胞增殖
分类号: R735.35
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是最常见的消化道肿瘤之一，在全球恶性肿瘤中位居第三位，近年来发病率仍在呈逐年增高的趋势。在全球每年超过一百万结直肠癌新发病例中，仅有大约20%具有家族史，其他结直肠癌发生与环境因素、特殊的肠道共生菌和病原体、以及慢性肠道炎症有关，其中由慢性炎症诱发的结肠肿瘤近年倍受关注。在诱导肿瘤发生的肠道炎症中，最常见的是炎性肠病，包括溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）和克罗恩氏病（Crohn’s Disease, CD）。已有流行病学证实在炎性肠病患者诊断8年-10年以后，结直肠癌的发生风险以每年0.5%-1%的速度递增。有30年病史的结肠炎患者中有超过20%会最终进展为结肠癌，而其中超过50%患者死于结肠癌并发症。病程时间和炎症程度与癌变风险呈正相关。这种由炎症性肠病反复发作，不断进展恶化的结直肠癌被称为结肠炎相关肿瘤（Colitis-associated Cancer，CAC）。目前认为炎性肠病反复发作时，免疫细胞功能紊乱，NF-κB，JAK/STAT等信号通路的异常活化，致使TNFα、IL-1、IL-6等促炎性因子表达增加，而异常高水平的促炎因子可进一步激活活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮中间体（Reactive nitrogen intermediates，RNI）的合成，改变组织细胞的生长、凋亡和增殖等生物学过程。此外，慢性炎症的持续存在还将导致Wnt，p53，K-ras，TGF-等信号通路的异常，最终诱发肿瘤。CUEDC2是一种含有CUE结构域的蛋白质，在许多肿瘤中高表达，如肾癌，卵巢癌和脑癌等。已有研究发现，CUEDC2能够与IKKα和IKKβ相互作用，通过减少IKKα/β的磷酸化抑制NFκB的活性。不仅如此，CUEDC2还可以通过与JAK/STAT3通路中SOCS3特异结合，抑制各种细胞因子诱导的JAK1和STAT3的磷酸化，负调控JAK/STAT信号通路。同时，CUEDC2还是一个有丝分裂进程中的关键调控因子，参与细胞周期的调控，其功能异常可导致染色体不稳定性和肿瘤的发生。因此，CUEDC2与炎症和肿瘤均有密切联系，深入探讨其在炎症诱导肿瘤中的作用机制，对于加深我们对这一基因功能的认识具有重要意义，也为研究“炎症诱导肿瘤”调控网络的分子机制提供了重要线索。动物模型能够模拟人类疾病的许多方面，在各种疾病的机制研究中具有重要意义。氧化偶氮甲烷（Azoxymethane, AOM）是一种化学致癌剂，代谢产物通过胆汁或血液系统进入肠道后，在肠道中被肠道菌群水解酶分解为游离化合物，作用于肠粘膜细胞，可能通过鸟嘌呤O6甲基化诱导突变损伤，发挥致癌作用。而化学致炎剂葡聚糖硫酸钠盐（Dextran sodium sulfate，DSS）可能通过破坏肠黏膜屏障、导致肠道菌群失调和巨噬细胞功能障碍等引起肠道炎症，而且由于粘膜损伤的持续存在，也可能诱发浸润于肠黏膜损伤部位的肥大细胞或巨噬细胞产生超氧负离子，促进了肿瘤的形成和生长。由于AOM/DSS模型能很好地重塑慢性肠道炎症诱发肿瘤的生理病理过程，近年来已被广泛用于炎症相关肿瘤形成机制的研究。基于实验室前期工作中发现CUEDC2参与负向调控NF-κB和STAT3信号通路，与炎症和肿瘤的进展过程相关，推测其在炎症诱导肿瘤形成过程发挥重要作用。本研究中利用CUEDC2基因敲除小鼠建立AOM/DSS诱导的结肠炎相关肿瘤模型，在AOM作用诱导细胞突变损伤基础上，周期性给予DSS刺激，模拟肠炎诱导肿瘤形成过程。实验中观察CUEDC2敲除组和野生型小鼠在结肠炎向结肠癌进展中其体重改变、排便状态，包括粪便性状和便血程度等临床症状变化，并对模型小鼠结肠炎肿瘤形成数目、肿瘤大小和肿瘤负荷量，以及肿瘤异型增生程度进行统计分析；结果发现CUEDC2敲除组小鼠在周期性DSS慢性炎症刺激下，其体重下降明显，腹泻和便血程度严重，而且最终形成的结肠肿瘤数目显著增多，肿瘤体积更大，肿瘤组织的异型性更为明显，肿瘤的浸润深度和异型增生程度均显著高于野生型。为了深入探讨CUEDC2对结肠肿瘤形成的影响，我们检测了结肠炎和结肠肿瘤组织中促炎细胞因子TNFα、IL-6、COX2和PGE2以及趋化因子MIP2和MCP1的表达水平，结果发现CUEDC2敲除小鼠结肠炎和肿瘤组织中的促炎因子表达明显高于野生型小鼠；同时利用免疫组化的方法检测肿瘤和炎性上皮细胞中增殖指标Ki67、BrdU和Cyclin D1的表达，提示CUEDC2敲除小鼠结肠肿瘤组织和炎症组织细胞的增殖程度均明显高于野生型小鼠。因此，CUEDC2敲除后上皮细胞增殖过度很有可能与高水平促炎因子在炎症进展肿瘤中的持续作用相关。为了更进一步揭示CUEDC2在炎症诱导肿瘤形成中的分子机制，对两种基因型小鼠的结肠炎组织进行免疫印迹实验，结果发现CUEDC2敲除小鼠结肠炎组织IKKα和STAT3的磷酸化持续时间明显长于野生型小鼠，由于NF-κB和STAT3是炎症和肿瘤信号通路中最重要的转录因子，其激活与炎症和肿瘤进程相关。因此，CUEDC2敲除小鼠肿瘤形成增多可能是通过调控NF-κB和STAT3通路，促进NF-κB和STAT3的持续活化，最终导致了细胞增殖过度，肿瘤形成增多。综上所述，我们的研究结果在动物水平上证实了CUEDC2在炎症诱导肿瘤过程中作为重要的功能基因发挥作用，CUEDC2可通过抑制NF-κB和STAT3的活化及炎性因子的表达，阻止肿瘤细胞过度增殖等过程在炎症向肿瘤进程中发挥保护作用。因此，此研究结果为深入探讨“炎症诱导肿瘤”的分子机制提供了研究线索，也表明CUEDC2有可能成为IBD病情评价和判断预后的重要标志物。

全文目录

缩略词表  5-6
摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-16
材料和方法  16-24
  1．材料和来源  16
    动物饲养  16
  2．主要试剂  16-18
    2.1 抗体  16
    2.2 PCR 试剂盒  16
    2.3 PCR 引物  16-17
    2.4 建立动物模型试剂  17
    2.5 常用溶液配方  17-18
  3．实验方法  18-24
    3.1 结肠炎相关肿瘤模型建立及评价  18-19
    3.2 DSS 诱导结肠炎模型建立及评价  19-20
    3.3 病理免疫组织化学检测  20-21
    3.4 实时荧光定量 PCR 检测  21-23
    3.5 免疫印迹实验  23
    3.6 统计分析  23-24
实验结果  24-50
  1. CUEDC2 敲除促进了小鼠 CAC 肿瘤形成  24-28
    1.1 CUEDC2 敲除小鼠肿瘤数目增多  24-25
    1.2 CUEDC2 敲除小鼠肿瘤大小和肿瘤负荷增加  25-26
    1.3 CUEDC2 敲除小鼠肿瘤形成中体重增长缓慢  26-27
    1.4 CUEDC2 敲除小鼠肿瘤形成中肠炎症状严重  27-28
  2. CUEDC2 敲除加重了小鼠 CAC 肿瘤异型增生程度  28-30
    2.1 CUEDC2 敲除后肿瘤异型增生程度增加  28-29
    2.2 CUEDC2 敲除小鼠肿瘤多为中重度异型增生  29-30
  3. CUEDC2 敲除促进了小鼠 CAC 肿瘤细胞的增殖  30-33
    3.1 结肠肿瘤细胞 PCNA 表达增加  30-32
    3.2 结肠肿瘤细胞 BrdU 染色增强  32-33
  4. CUEDC2 敲除小鼠对 DSS 诱导的结肠炎易感性增加  33-37
    4.1 结肠炎体重下降明显  33-34
    4.2 结肠炎腹泻持续时间延长  34-35
    4.3 结肠炎症状严重  35-36
    4.4 结肠缩短明显  36
    4.5 结肠炎溃疡程度严重  36-37
  5. CUEDC2 敲除促进了小鼠结肠炎上皮细胞的增殖  37-40
    5.1 结肠炎上皮细胞 Ki67 表达增加  38-39
    5.2 结肠炎上皮细胞 BrdU 染色增强  39
    5.3 结肠炎上皮细胞 Cyclin D1 表达增加  39-40
  6. CUEDC2 敲除促进了小鼠结肠炎中促炎因子的表达  40-45
    6.1 结肠组织 IL-6 的 mRNA 水平增加  40-41
    6.2 结肠组织 TNF 的 mRNA 水平增加  41-42
    6.3 结肠组织 COX2 和 PGE2 的 mRNA 水平增加  42-43
    6.4 结肠组织 MIP2 的 mRNA 水平增加  43
    6.5 结肠组织 MCP1 的 mRNA 水平增加  43-44
    6.6 结肠组织 iNOS 的 mRNA 水平无明显增加  44-45
  7. CUEDC2 敲除小鼠结肠肿瘤组织促炎因子表达增加  45-47
    7.1 结肠肿瘤组织 IL-6 和 TNF 的 mRNA 水平增加  45-46
    7.2 结肠肿瘤组织 COX2 和 MIP2 的 mRNA 水平增加  46-47
  8. CUEDC2 敲除导致结肠炎组织中 NF- B 和 STAT3 的活化增强  47-50
    8.1 CUEDC2 敲除导致了小鼠结肠炎组织 STAT3 的过度激活  47-48
    8.2 CUEDC2 敲除导致了小鼠结肠炎组织 NF- B 的持续活化  48-50
讨论  50-52
结论  52-53
参考文献  53-59
附表  59-60
综述  60-77
  参考文献  69-77
发表文章  77-93
个人简历  93-94
致谢  94-95

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