学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

肿瘤组织及血浆KRAS突变与结直肠癌患者预后的相关性研究

作　者: 刘晓静
导　师: 宋三泰; 徐建明
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 转移性结直肠癌 KRAS突变直接测序法 PNA-PCR 血浆
分类号: R735.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 142次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

随着新型抗肿瘤药物的不断出现，晚期结直肠癌治疗的有效率及患者的总生存时间不断提高，特别是靶向药物EGFR（Epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体）单抗的应用，联合化疗可以使患者的生存期延长到两年，而且研究已经发现了EGFR单抗的疗效预测因子，即KRAS基因突变。在用药前，通过检测患者肿瘤组织的KRAS基因是否发生突变，来筛选敏感人群，初步达到了个体化应用。但是在个体化应用过程中，也存在一些很大的缺陷，由于肿瘤组织取材比较困难，而且不具备实时性，因此，找到能够满足实时性、方便可取，含有肿瘤组织遗传信息的替代物来代替肿瘤组织进行基因检测，就成了目前亟待解决的一个问题。随着检测技术的发展，KRAS基因突变的检测方法也面临着改革，有研究提出，目前公认的测序方法，灵敏度较低，可能会导致假阴性结果的出现，应该用灵敏度高的方法来检测。我们考虑灵敏度不同的两种方法检测，肯定会存在一类患者，即灵敏度低的方法检测为野生型，但灵敏度高的方法可能检测为突变型，也就是说这部分患者突变的量可能比较低。对于这部分患者，是否适合应用EGFR单抗，除了KRAS是否发生突变之外，KRAS突变的量（突变丰度）是否会对EGFR单抗的疗效及患者的预后产生影响？这在目前还没有任何相关的研究。KRAS突变虽然是EGFR单抗的疗效预测因子，但与单纯化疗患者预后的相关性目前仍然存在分歧，存在分歧的原因复杂，我们认为其中较为重要的一点，可能是因为各种研究采用的检测方法没有统一，检测方法的灵敏度高低不同。因此，为了探讨检测方法的不同对KRAS突变与单纯化疗患者预后相关性的影响；KRAS突变丰度对单纯化疗的患者疗效和预后的关系；以及血浆替代肿瘤组织进行KRAS基因突变检测的可行性，我们开展了此项研究。从2008年1月到2011年6月筛选接受过至少两个方案的单纯化疗（奥沙利铂为主或者伊立替康为主的方案）的晚期结直肠癌患者117例，根据RECIST（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，实体瘤疗效评价标准）评价标准，一线化疗有37例患者获得部分缓解（Partial response，PR）（31.6%），全体患者的中位PFS（Progression free survival，无进展生存时间）是6.3个月，中位OS（Overall survival，总生存时间）是19.5个月。用直接测序法和PNA-PCR（Peptide NucleicAcid-mediated PCR Clamping，肽核酸钳制PCR）方法分别检测了患者的肿瘤组织和配对血清中的KRAS突变状态，直接测序法检测肿瘤组织KRAS突变的患者46例，检出率为39.3%，血浆中KRAS突变的患者18例，检出率15.4%，与肿瘤组织的一致率为32.6%，野生与突变整体的一致率为70.9%，一致性较差（Kappa0.318，p<0.001）。用PNA-PCR方法检测肿瘤组织和血浆的KRAS基因突变，肿瘤组织KRAS突变的患者56例，检出率为47.9%，血浆中KRAS突变的患者35例，检出率为29.9%，与肿瘤组织的一致率为55.4%，野生与突变整体的一致性率为75.2%，一致性一般（Kappa0.496，p<0.001）。肿瘤组织的KRAS突变用直接测序法检测，而血浆用PNA-PCR方法检测，发现血浆与肿瘤组织的KRAS突变的一致率为63.0%，整体一致率为80.3%，一致性较好（Kappa0.570，p<0.001）。从以上结果我们可以看出，因为血浆游离DNA中含有的肿瘤组织特异性DNA量很低，因此更适合用灵敏度高的检测方法进行KRAS基因突变的检测，提高与肿瘤组织KRAS突变的一致率。将肿瘤组织的KRAS突变状态与单纯化疗的疗效进行统计分析发现，无论用直接测序法或者PNA-PCR方法，野生型与突变型的患者在ORR（Over responserate，总有效率）及PFS均没有统计学差异。在患者的预后方面，直接测序法检测的野生型与突变型患者在OS上的差异接近统计学意义（p=0.052），PNA-PCR方法检测的野生型与突变型患者的OS具有明显的统计学差异(p=0.010)。根据直接测序法和PNA-PCR方法的KRAS检测结果（KRAS突变丰度）将患者分为野生型组（两种方法检测的KRAS均为野生型）、高突变组（两种方法检测的KRAS均为突变型）和低突变组（直接测序法检测的为野生型，而PNA-PCR方法为突变型），三组患者在ORR及PFS上仍然没有差异，但野生型组患者的中位OS可长达21.3个月，低突变组的17.1个月，而高突变组的15.6个月，差异具有明显的统计学意义（p=0.033）。将这三组进行两两比较，结果显示，野生型组与高突变组OS的差异具有显著的统计学意义（p=0.029），与低突变组OS的差异接近统计学意义（p=0.058）。而高突变组和低突变组间的OS没有统计学差异。由此我们可以看出，低突变组的OS接近高突变组，野生型组的OS还是最长的。直接测序法或PNA-PCR方法检测的血浆中KRAS突变状态对单纯化疗的疗效没有影响，但与患者的OS具有明显的相关性。直接测序法检测的野生型患者比突变型患者中位OS长5个月，有统计学差异（p=0.009）。同样的，用PNA-PCR方法检测的野生型和突变型患者的OS分别是21.3个月和15.1个月，差异也具有明显的统计学意义（p=0.001），以上结果说明血浆中的KRAS基因突变状态与患者的OS存在相关性，KRAS突变的患者预后很差。血浆中KRAS突变可以作为单纯化疗患者预后的预测因子。以上结果表明，用PNA-PCR方法检测血浆中的KRAS突变与肿瘤组织的一致性较高，在肿瘤组织获取困难时，可以考虑通过检测血浆中KRAS基因的突变来指导个体化用药。不论何种方法检测KRAS基因突变，KRAS突变与单纯化疗的疗效没有相关性，不能作为疗效的预测因子。但是对于KRAS突变与单纯化疗患者预后的相关性，不同检测方法导致了不同的结论，从而证实目前研究中KRAS突变与单纯化疗患者的预后存在分歧的原因之一，可能就是检测方法的不同导致的。在本研究中，用直接测序法检测的野生型和突变型患者的OS没有统计学差异，而PNA-PCR方法检测的野生型和突变型患者的OS有明显的差异，因此，灵敏度高的PNA-PCR方法可能比直接测序法更适合肿瘤组织KRAS突变的检测。通过分析野生型组、高突变组和低突变组的OS发现，野生型患者的OS最长，低突变组的次之，高突变组的最短。因此如果按照KRAS基因突变的丰度进行更详细的分组，可能对预测患者的预后具有更重要的意义。这提示我们应该联合两种方法进行KRAS基因突变的检测，野生型患者最好用PNA-PCR方法来确定，从而能够降低假阴性结果的出现，而突变型患者则用传统的方法--直接测序法来确定，避免灵敏度高的方法，如PNA-PCR方法对KRAS微量突变的夸大，更好的预测患者的预后。而对于血浆中的KRAS突变，不论用哪种方法，KRAS突变都与患者的疗效没有相关性，但与患者的预后却存在明显的相关性，说明血浆中的KRAS突变是患者预后的预测因子。结论：不同的检测方法对KRAS突变预测单纯化疗患者的预后带来不同的结论，可能是导致目前KRAS突变与患者预后存在分歧的重要原因之一。灵敏度高的PNA-PCR方法联合传统的直接测序法进行KRAS突变的检测，将患者按照KRAS突变丰度进行分组，可能会对患者的预后具有更大的帮助。血浆中KRAS突变的检测推荐使用灵敏性高的方法，突变的患者预后较差。当患者的肿瘤组织获取困难时，血浆也可以考虑作为肿瘤组织的替代物进行KRAS基因突变的检测。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-10
Abstract  10-15
前言  15-19
第一章肽核酸钳制 PCR 方法的建立和优化  19-33
  1 材料与方法  19-27
    1.1 材料与仪器  19-20
    1.2 方法  20-27
  2 结果与分析  27-30
    2.1 嵌套式 PCR 条件优化结果  27
    2.2 模板有效浓度梯度摸索  27-28
    2.3 PNA 与引物的浓度最适比例  28-30
    2.4 肽核酸钳制 PCR 技术对突变基因的扩增效率  30
  3 讨论  30-32
  4 小结  32-33
第二章肿瘤组织 KRAS 突变与结直肠癌患者预后的相关性研究  33-45
  1 材料与方法  33-35
    1.1 材料  33
    1.2 方法  33-35
  2 结果与分析  35-43
    2.1 患者筛选的条件  35-36
    2.2 KRAS 基因突变检测结果  36-39
    2.3 KRAS 突变与结直肠癌患者疗效和预后分析  39-41
    2.4 KRAS 突变丰度与与患者疗效和预后分析  41-43
  3 讨论  43-44
  4 小结  44-45
第三章血浆游离 DNA 中 KRAS 突变与结直肠癌患者预后的相关性研究  45-53
  1 材料与方法  45-47
    1.1 材料与仪器  45
    1.2 方法  45-47
  2 结果与分析  47-51
    2.1 血浆游离DNA的KRAS突变与肿瘤组织的一致性  47-48
    2.2 血浆游离 DNA 中 KRAS 突变与患者预后的相关性  48-50
    2.3 血浆游离 DNA 中 KRAS 突变丰度与患者的疗效和预后分析  50-51
  3 讨论  51-52
  4 小结  52-53
论文创新点  53-54
论文总结及下一步工作  54-55
参考文献  55-59
文献综述  59-66
  参考文献  64-66
附相关论文  66-76
个人简历  76-77
致谢  77

肿瘤组织及血浆KRAS突变与结直肠癌患者预后的相关性研究

内容摘要

全文目录

相似论文