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新型抗胆碱药R2HBJJ抑制肺癌细胞增殖作用及机制研究

作　者: 华南
导　师: 郑建全
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 抗胆碱药 R2HBJJ 非小细胞肺癌 细胞增殖 G0/G1 期阻滞
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


肺癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤之，发病率和死亡率逐年上升。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌患者的80%以上。尽管外科手术与放疗化疗的联合应用日臻完善，对肺癌的疗效不断提高，但其5年生存率仍低于20%。因此迫切需要发展新的治疗方法。目前研究表明，肺癌细胞能够合成和分泌乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）作为种生长因子，构建自分泌促增殖网络，参与并促进肺癌的发展进程。毒蕈碱型胆碱能受体（muscarinic cholinergic receptor, M受体）的M3亚型与烟碱型胆碱能受体（nicotinic cholinergic receptor, N受体）的7亚型的选择性拮抗剂，均能抑制肺癌细胞中过度激活的胆碱能信号，从而抑制肺癌细胞增殖，为肺癌的预防和治疗提供了新的药物研发策略。R2HBJJ是由抗胆碱药盐酸戊乙奎醚衍生得到的季铵盐，本研究的目的是考查R2HBJJ的抗胆碱特性，评价其对非小细胞肺癌细胞增殖的影响，并探讨可能的作用机制以及用于NSCLC治疗的潜在可能性。结果如下：1.放射性配体受体结合实验表明，R2HBJJ能竞争性抑制[3H]-NMS与M受体结合，抑制作用随药物浓度增加而增强，对M1-5受体的竞争抑制平衡解离常数Ki值依次为7.86±3.39×10-11、1.33±0.52×10-9、6.79±3.71×10-11、1.06±0.12×10-10和2.64±0.98×10-10M（n=3, F=121.2, P <0.01），R2HBJJ对M3和M1受体显示出较高的亲和力。R2HBJJ抑制卡巴胆碱所诱发豚鼠支气管平滑肌收缩的IC50为7.58±1.05×10-9M（n=5）。2.采用全细胞膜片钳记录ACh诱发的大鼠背根神经节（Dorsal root ganglion, DRG）神经元电流，R2HBJJ能浓度依赖性阻断该电流，1μM、10μM、20μM R2HBJJ对电流的阻断率分别为29.31±5.76%、91.35±1.03%、99.07±0.14%（n=3或5）。利用爪蟾卵母细胞分别表达大鼠7和9/10受体，使用双电极电压钳技术记录ACh诱发的电流。100μM R2HBJJ能完全阻断100μM ACh诱发的7受体电流（n=3），200μM R2HBJJ对200μM ACh诱发的9/10受体电流的阻断率为76.74±6.17%（n=4）。提示R2HBJJ具有阻断DRG神经元N受体以及在爪蟾卵母细胞上表达的大鼠7受体和9/10受体亚型的作用。3.用磺酰罗丹明B（sulforhodamine B, SRB）法测定了R2HBJJ作用后细胞活力变化。R2HBJJ在体外能浓度依赖性地抑制NSCLC细胞H1299、H460和H157生长，作用72h后半数生长抑制浓度GI50依次为8.5±0.15、8.8±0.42、28.5±0.75μM（n=6），但对A549细胞生长无明显抑制作用。R2HBJJ在10-40μM明显抑制肺癌细胞生长的浓度范围内，不抑制正常人支气管上皮细胞BEP2D生长。对其它17种不同组织类型的肿瘤细胞研究显示，不同的细胞对R2HBJJ具有不同的敏感性。4. ACh能浓度依赖性拮抗R2HBJJ对H1299细胞增殖的抑制作用。以正常细胞为对照，分别伴随给予0、0.3、1、3、10、30、100μM ACh，细胞活力显著增加，72h后R2HBJJ10μM组细胞活力分别为57.08±1.62%、65.61±4.52%、56.64±7.01%、74.92±5.42%、82.92±6.08%、88.76±0.86%和91.41±3.99%（n=6）；R2HBJJ20μM组细胞活力分别为19.67±2.15%、33.37±1.77%、24.53±1.76%、29.88±5.18%、35.72±4.26%、42.37±2.12%和58.17±4.38%（n=6）。5.在H1299、H157、H460、A549和BEP2D细胞上应用RT-PCR方法检测了胆碱能受体（Acetylcholine receptors,AChRs）和胆碱乙酰转移酶（Cholineacetyltransferase, ChAT）的表达。ChAT在这几种细胞中均有表达；M1-5、7、9、10、β2和β4受体的表达有明显差异，但并没有发现与对R2HBJJ敏感性特异相关的受体亚型表达。6.以H1299细胞为模型，对比R2HBJJ和不同亚型选择性AChRs拮抗剂对其增殖的抑制作用。M3受体选择性拮抗剂达非那新的抑制作用与R2HBJJ相似，但弱于R2HBJJ。7受体选择性拮抗剂-Bungarotoxin（-bgt）和N受体非选择性拮抗剂美加明，在10μM内对H1299生长抑制作用均强于R2HBJJ。M1受体选择性拮抗剂哌仑西平、M2/M4受体选择性拮抗剂AF-DX116、M受体非选择性拮抗剂阿托品、4/β2和4/β4受体选择性拮抗剂DhβE抑制作用弱。提示R2HBJJ抑制H1299细胞生长的作用主要由M3受体和7受体介导，其它受体亚型可能同时参与该过程。7.用流式细胞术（Flow cytometry, FCM）考察了R2HBJJ对细胞凋亡和细胞周期的影响。用20μM R2HBJJ处理H1299细胞24、48、72h，细胞凋亡没有明显变化，但随着作用时间的延长，细胞周期G0/G1期比值由42.54±2.11%上升到76.21±2.75%，而S期则由46.78±1.40%下降到18.37±2.45%（n=3, P＜0.01），表明R2HBJJ能时间依赖性诱导H1299细胞产生G0/G1期阻滞。此外，R2HBJJ还能浓度依赖性诱导H1299和H157细胞产生G0/G1期阻滞。8.使用Western Blot方法，分析了调控细胞周期G1检查点信号网络的关键蛋白及其上游信号分子表达水平的变化。R2HBJJ可时间及浓度依赖性下调cyclin D1、CDK4、CDK6表达，抑制Rb磷酸化，而对cyclin E和CDK2的表达影响小，这表明R2HBJJ诱导的细胞周期阻滞发生在G0/G1的早期。进步的实验表明R2HBJJ可时间依赖性下调Thr308p-Akt、c-Myc和Ser9p-GSK3β，提示R2HBJJ能在不同机制介导下使得PI3K/Akt通路激活受到抑制，从而导致Akt和它下游的c-Myc和GSK3β的磷酸化水平下调，使得细胞周期蛋白的表达和稳定性发生改变，最终导致细胞周期进程阻滞于G0/G1期。此外，R2HBJJ还能经由JNK通路抑制Tyr705p-Stat3核转位，从而抑制参与G1期向S期转化的下游信号分子转录。本研究表明新型抗胆碱药R2HBJJ对五种M受体亚型有不同的亲和力，但主要选择拮抗M3和M1受体。R2HBJJ能阻断ACh诱发的DRG神经元电流以及在爪蟾卵母细胞上表达的7受体和9/10受体电流。R2HBJJ通过拮抗M受体和N受体而抑制NSCLC细胞增殖，ACh能浓度依赖性阻断R2HBJJ的抑制作用。R2HBJJ主要经由PI3K/Akt通路下调细胞周期G1检查点调控蛋白Ser807/811p-Rb、cyclin D1、CDK4和CDK6的表达，诱导细胞发生G0/G1期阻滞。此外，R2HBJJ还能经由JNK通路抑制Tyr705p-Stat3核转位，从而抑制参与G1期向S期转化的下游信号分子转录。R2HBJJ诱导NSCLC细胞发生G0/G1期阻滞是其抑制细胞增殖的主要机制，但其体内抗肿瘤作用仍需进步研究。本研究为非神经元胆碱能系统参与NSCLC细胞增殖的调控提供了新的佐证，并为新型抗胆碱药R2HBJJ用于NSCLC治疗的潜在可能性提供了实验依据。

全文目录


缩略词表  6-8
摘要  8-11
Abstract  11-15
前言  15-18
第一章：R2HBJJ 抗胆碱特性研究  18-38
  材料  18-20
  方法  20-27
  结果  27-35
    1. [~(3)H]-NMS 与五种 M 受体亚型饱和结合实验  27
    2. R2HBJJ 对五种 M 受体亚型有不同的亲和力  27-29
    3. R2HBJJ 抑制豚鼠支气管平滑肌收缩  29
    4. R2HBJJ 阻断 ACh 诱发的 DRG 神经元电流  29-33
    5. R2HBJJ 阻断 ACh 诱发的爪蟾卵母细胞表达的 α7、α 9/ α10 受体电流  33-35
  讨论  35-38
第二章：R2HBJJ 体外抑制肺癌细胞增殖作用及机制研究  38-62
  材料  38-39
  方法  39-46
  结果  46-58
    1. R2HBJJ 在体外抑制肿瘤细胞增殖  46-48
    2. ACh 拮抗 R2HBJJ 对 H1299 细胞增值的抑制作用  48-49
    3. NSCLC 细胞表达 AChRs 与 ChAT  49-50
    4. R2HBJJ 与不同亚型选择性 AChRs 拮抗剂抑制 H1299 细胞增殖作用比较  50-51
    5. R2HBJJ 诱导 H1299 细胞凋亡  51-52
    6. R2HBJJ 诱导 NSCLC 细胞产生 G0/G1 期阻滞  52-56
    7. R2HBJJ 下调 cyclinD1、CDK4、CDK6 表达并抑制 Rb 磷酸化  56-57
    8. R2HBJJ 下调 Akt、c-Myc 和 GSK3β的表达  57
    9. R2HBJJ 上调~(Thr183/Tyr185)p-JNK 表达  57-58
    10. R2HBJJ 抑制~(Tyr705)p-Stat3 核转位  58
  讨论  58-62
结论  62-63
参考文献  63-68
综述  68-82
  参考文献  76-82
论著  82-90
个人简历  90-92
致谢  92

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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