学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

磷酸化CUEDC2调节细胞有丝分裂的分子机制研究

作　者: 高彦飞
导　师: 张学敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: CUEDC2 纺锤体检查点 APC/C 非整倍体
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 59次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

有丝分裂是细胞生命活动的重要特征之一,从1880年发现开始,一直受到生物学家的重视。经过长期的研究探索,科学家们发现有丝分裂期内存在一个保证其正确运行的监督机制——纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)。相关研究发现,纺锤体组装检查点是维持基因组稳定性的重要环节,其缺陷经常会导致非整倍体(aueuploidy)细胞的出现。经过进一步研究科学家们发现,非整倍体与肿瘤的发生发展之间存在着密切的联系。因此,纺锤体组装检查点相关的分子机制探索,以及以此为肿瘤治疗药靶的研究已成为当今科学研究的一个热点。有丝分裂期的主要任务是将S期复制的染色质准确均匀地到两个子代细胞中,而纺锤体组装检查点则负责监督整个过程能够正确完成。纺锤体组装检查点主要检查姐妹染色单体两侧的动粒是否与来自各自同一极的微管连接正确。当细胞内存在与微管没有正确连接的动粒时,纺锤体组装检查点将被激活,使细胞停滞于前中期。直到所有动粒与微管均连接正确,纺锤体组装检查点才会灭活,并进一步解除其对泛素E3酶-细胞周期后期促进复合物( anaphase promoting complex, cyclosome, APC/C)的抑制。激活的APC/C通过泛素化Cyclin B及Securin促使细胞周期由中期向后期转化。就分子机制而言,虽然纺锤体组装检查点激活机制的相关研究已经比较深入,但是对于纺锤体组装检查点灭活机制及受其调控的APC/C的激活的机制至今还不清楚。CUEDC2(CUE domain containing protein 2)是一个由本实验室首先克隆并表达,由287个氨基酸组成且功能尚未完全阐明的蛋白质。本研究中我们发现CUEDC2除抑制孕激素受体PR的转录活性及抑制NF-κB通路的激活外,在有丝分裂期同样发挥了重要地功能。通过一系列实验证明,CUEDC2是一个新的有丝分裂调节因子,它在纺锤体组装检查点灭活过程中发挥了重要作用。首先,我们通过体外激酶实验证明CUEDC2是Cdk1的底物,Cdk1磷酸化CUEDC2的第110位丝氨酸。然后,在HeLa细胞中瞬时干涉CUEDC2,观察对有丝分裂期相关的表型及分子的影响。我们发现,干涉CUEDC2后使用较低浓度的Nocodazole即可将细胞有效阻滞于有丝分裂期,且在Nocodazole释放后,干涉CUEDC2使细胞逃离有丝分裂期的速度变慢。通过检测中后期转化的重要调节因子Cyclin B及Securin的蛋白质水平,我们发现干涉CUEDC2能够延迟Cyclin B及Securin的降解。这一现象在另外的细胞系得以进一步确证。进一步实验我们发现外源表达的野生型CUEDC2能够逆转干涉CUEDC2引起的Cyclin B降解延迟现象。但是同样条件下,表达非磷酸化突变体CUEDC2(S110A)却不能逆转干涉CUEDC2引起的Cyclin B降解延迟。接下来,我们又利用体外降解系统证明CUEDC2影响了APC/C的泛素E3酶活性。为了研究CUEDC2是否直接影响APC/C泛素E3酶活性,我们检测了前中期Cyclin A的降解。结果发现CUEDC2并不影响Cyclin A的降解。由于APC/C对Cyclin A的降解不受纺锤体组装检查点的调控,而APC/C对Cyclin B以及Securin的降解则要受到纺锤体组装检查点的抑制,因此我们推断CUEDC2是在纺锤体组装检查点灭活的过程中影响APC/C的活性。通过免疫沉淀实验我们发现在有丝分裂前中期CUEDC2可以与APC/C-Cdc20-Mad2存在于同一复合物中。通过外源共表达蛋白并进行免疫沉淀我们发现CUEDC2可以与Cdc20直接结合且这种结合依赖于CUEDC2的磷酸化。为进一步研究CUEDC2如何影响纺锤体组装检查点调控的APC/C的E3酶活性,我们检测了CUEDC2是否参与了前中期向中期转化过程中Mad2与Cdc20的解离过程,即APC/C活性被释放的过程。我们发现干涉CUEDC2导致Mad2与Cdc20的解离速率变慢。这一结果通过Taxol加MG132加ZM447439的实验体系得以进一步确证。为进一步研究其分子机制,我们利用纯化蛋白的体外实验证明CUEDC2对Mad2与Cdc20结合的影响不是通过占位竞争模式实现的。通过上述实验我们得出结论,Cdk1磷酸化CUEDC2,使其与Cdc20结合。CUEDC2通过Cdc20进一步结合到APC/C-Cdc20-Mad2复合物,促进Mad2与Cdc20的解离,即纺锤体组装检查点的灭活。检查点的灭活APC/C激活以及细胞中后期的转化。最后,为进一步研究CUEDC2过表达能否引起纺锤体组装检查点提前灭活的相关表型,我们在MCF10A细胞中稳定过表达野生型CUEDC2及CUEDC2(S110A)。经过染色体核型分析我们发现过表达野生型CUEDC2引起了非整倍体细胞比例的增加。由于非整倍体与肿瘤的关系十分密切,为探索CUEDC2蛋白表达水平与肿瘤之间的关系,我们利用免疫组化实验检测了脑癌组织样本中CUEDC2的蛋白质表达水平。结果发现CUEDC2在脑癌组织中高表达,且表达量与脑癌的恶性程度呈正相关。综上所述,我们发现了一个新的有丝分裂期调节因子——CUEDC2。有丝分裂期CUEDC2被Cdk1磷酸化后与Cdc20相互作用,进而促进Mad2从APC/C-Cdc20上解离,在APC/C由被检查点抑制到激活的过程中发挥重要功能。除此之外,我们还发现,CUEDC2的过表达可以导致非整倍体细胞的出现以及脑癌组织中CUEDC2高表达。本文不仅为纺锤体组装检查点及时灭活这一重要过程提供了新的机制,而且还揭示了一个潜在的肿瘤治疗靶点——CUEDC2。

全文目录

缩略词表  7-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
前言  12-16
材料与方法  16-25
  1. 材料及来源  16-18
    1.1. 菌株、质粒和干涉序列  16
    1.2. 细胞培养试剂  16
    1.3. 抗体  16-17
    1.4. 其他主要试剂  17
    1.5. 常用溶液配方  17-18
    1.6. 主要实验仪器  18
  2. 实验方法  18-25
    2.1. 细胞培养  18
    2.2. siRNA干涉  18
    2.3. 流式细胞术  18-19
    2.4. Thymidine - Nocodazole 同步化法  19
    2.5. Nocodazole 阻滞释放同步化法  19
    2.6. Western Blot蛋白印记杂交  19-20
    2.7. 定点突变质粒构建  20
    2.8. 免疫沉淀方法一  20
    2.9. 有丝分裂期细胞裂解液的制备  20-21
    2.10. 免疫沉淀方法二  21
    2.11. GST-CUEDC2 融合蛋白在大肠杆菌中的表达  21-22
    2.12. 体外降解体系的建立  22
    2.13. 体外激酶实验  22
    2.14. 昆虫表达CUEDC2 蛋白的纯化  22
    2.15. 染色体核型分析.  22-23
    2.16. 免疫组织化学实验  23-24
    2.17. 免疫组化结果的判读及统计分析  24-25
结果  25-47
  1. 体外激酶实验证明CUEDC2 是Cdk1 的底物  25
  2. 干涉CUEDC2 对有丝分裂期的影响  25-27
  3. CUEDC2 影响细胞出有丝分裂期  27
  4. CUEDC2 影响Cyclin B1 和Securin的降解  27-30
    4.1. 干涉CUEDC2 使Cyclin B1 和Securin的降解延迟  27-28
    4.2. 干涉引起的Cyclin B1 降解延迟能够被再表达野生型CUEDC2 逆转  28-29
    4.3. U20S细胞中验证CUEDC2 对Cyclin B1 和Securin降解的影响  29-30
  5. 体外降解体系中验证CUEDC2 影响APC/C的泛素E3 酶活性  30-33
    5.1. 体外降解体系的建立  30-31
    5.2. 体外降解体系中主要依赖APC/C发挥泛素E3 酶活性  31-32
    5.3. 体外降解体系中CUEDC2 影响Cyclin B1 和Securin的降解  32
    5.4. 体外降解体系中CUEDC2 影响Geminin的泛素化  32-33
  6. CUEDC2 不影响前中期Cylcin A的降解  33-34
  7. CUEDC2 有丝分裂期与APC/C-Cdc20 相互作用  34-37
    7.1. 有丝分裂期CUEDC2 相互作用蛋白的检测（Nocodazole阻滞）  34-35
    7.2. 有丝分裂期CUEDC2 相互作用蛋白的检测（Thymidine释放）  35
    7.3. CUEDC2 与APC/C复合物结合的动态过程  35-36
    7.4. CUEDC2 可以与Cdc20 结合  36
    7.5. CUEDC2 与Cdc20 的结合依赖于CUEDC2 的磷酸化  36-37
  8. CUEDC2 影响Mad2 与Cdc20 解离的速率  37-43
    8.1. 干涉CUEDC2 使 Mad2 与Cdc20 的解离速率变慢  37
    8.2. TMZ体系中验证CUEDC2 对Mad2 与Cdc20 解离的影响  37-38
    8.3. 体外降解体系中CUEDC2 及其突变体对 Mad2 与Cdc20 解离的影响  38-39
    8.4. 体外降解体系中CUEDC2 及其突变体对Geminin泛素化的影响  39-40
    8.5. 免疫缺失实验验证干涉实验结果  40-41
    8.6. 纯化蛋白体外实验排除占位式竞争可能性  41-43
  9. 分子机制模型图  43
  10. CUEDC2 的过表达导致细胞系染色体不稳定  43-45
    10.1. 过表达CUEDC2 导致非整倍体的产生  43-45
    10.2. 过表达CUEDC2 导致细胞传代中染色体不稳定  45
  11. 免疫组化实验检测CUEDC2 在脑癌组织中高表达  45-47
结论  47-48
讨论  48-50
参考文献  50-54
综述  54-69
  参考文献  64-69
个人简历  69-70
致谢  70-71

磷酸化CUEDC2调节细胞有丝分裂的分子机制研究

内容摘要

全文目录

相似论文