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猪APC1和APC2基因的分离、鉴定及其功能的初步研究

作　者: 邵淑敏
导　师: 蒋思文
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 APC 基因家族 进化分析 细胞分化
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
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内容摘要


腺瘤样结肠息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein, APC)是家族性结肠息肉瘤(family adenomatous polyposis, FAP)以及散发性结肠癌的抑癌基因,该基因的突变与癌症的发生有密切关系。APC基因编码的APC蛋白是一个多功能肿瘤抑制蛋白家族,可与细胞内蛋白如Axin-2、JUP、EB1和微管蛋白等相互作用,调节细胞内功能。APC通过调节Wnt信号通路中β-catenin的水平,抑制Wnt信号通路,从而控制肠、皮肤、免疫系统、骨和脑中的细胞增殖和分化。用富含亚麻籽来源的不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)日粮饲喂生长育肥猪,可以提高育肥猪肌肉重和肌内脂肪含量,利用基因芯片技术分析发现Wnt信号通路中的基因均有明显的表达差异,其中APC基因的差异性最大,因此选取APC基因为研究对象。在本研究中,分离和克隆了猪APC基因家族的APC1和APC2两个基因,并比较分析了APC1和APC2的基因结构、功能特征、蛋白进化关系和组织表达模式。研究PUFA对APC基因家族表达的影响以及APC基因家族在脂肪细胞分化过程的作用。本研究所得的主要结果如下：1.利用电子克隆的方法获得猪APC1和APC2基因的cDNA序列。获得猪APC1基因cDNA序列8829 bp,包含一个最长为8367 bp的开放阅读框,编码2788个氨基酸,APC1蛋白含有ARM(armadillo)重复序列、APC碱性结构域、EB1结合区域等保守结构；猪APC2基因cDNA序列全长为7067 bp,包含一个最长为6798 bp的开放阅读框,编码2265个氨基酸,APC2蛋白含有ARM重复序列,APC肿瘤抑制蛋白区域,APC碱性结构域等保守结构域。2.根据所公布的猪基因组物理图谱数据库,将猪APC1和APC2基因分别定位在猪2q24和2q11。根据GenBank数据库中公布的各物种APC家族蛋白序列,利用MEGA 4.1软件分析APC家族蛋白的进化关系,发现APC蛋白家族在物种间具有高度的保守性。3.利用生物信息学软件分析猪APC1和APC2基因启动子区域,发现猪APC1基因启动子区没有CpG岛的存在,猪APC2基因启动子区的235～448和589～821区域存在CpG岛,猪APC1和APC2基因的启动子区存在大量的脂肪形成相关的转录因子结合位点。4.利用半定量RT-PCR的方法检测了猪APC1和APC2基因在猪体各组织中的表达情况,发现猪APC1和APC2基因在猪10个组织均有表达,表达具有广泛性。5.利用酶消化法成功分离猪ADSCs,并利用免疫组织化学和分子生物学方法检测细胞标记蛋白CD44的表达情况,CD44呈阳性表达,说明分离到的细胞是猪ADSCs.6.通过用不同浓度的ω-3 PUFA和ω-6 PUFA处理猪ADSCs,检测PUFA对APC基因家族的影响,发现随着PUFA浓度的增加,APC基因的mRNA的表达水平逐渐上调,两者之间存在剂量依赖关系。7.利用成脂诱导剂对猪ADSCs进行诱导分化,利用定量PCR和Western blot检测APC1和APC2基因在脂肪细胞分化过程中的表达情况,发现APC1和APC2基因在脂肪细胞分化早期高表达,同时检测Wnt信号通路相关基因β-catenin、GSK3β和Axin基因在脂肪细胞分化过程中的表达,发现在分化过程中β-catenin的mRNA和蛋白水平都显著降低,GSK3β的表达趋势和APC的表达趋势是一致的,Axin则表现出先降低后升高的趋势,即在分化后期表达量升高。APC在脂肪形成中的作用可能是通过调节β-catenin而发挥作用。

全文目录


摘要  11-13
Abstract  13-16
中英文缩写对照表  16-17
第一章 文献综述  17-37
  1 前言  17-18
  2 脂肪细胞的分化与其相关的转录因子  18-23
    2.1 脂肪细胞的来源及分化  18-19
      2.1.1 间充质干细胞  18
      2.1.2 脂肪母细胞  18
      2.1.3 前体脂肪细胞  18
      2.1.4 成熟脂肪细胞  18-19
    2.2 影响脂肪细胞分化的转录因子  19-23
      2.2.1 过氧化物酶体增殖物激活受体家族  20-21
      2.2.2 CAAT/增强子结合蛋白家族  21-22
      2.2.3 固醇调节元件结合蛋白家族  22-23
  3 Wnt/β-catenin信号通路概述  23-28
    3.1 Wnt/β-catenin信号通路的主要成员  23-25
      3.1.1 Wnt蛋白  23-24
      3.1.2 Frizzled蛋白  24
      3.1.3 β-catenin蛋白  24
      3.1.4 Dishevelled蛋白  24
      3.1.5 LEF-1/TCF转录因子家族  24-25
    3.2 Wnt/β-catenin信号通路与脂肪形成  25-28
      3.2.1 Wnt/β-catenin信号通路的信号传递  25-26
      3.2.2 Wnt/β-catenin信号通路与脂肪形成  26-27
      3.2.3 Wnt/β-catenin信号通路调控脂肪形成的机制  27-28
  4 APC基因家族的研究进展  28-31
    4.1 APC基因家族概述  28
    4.2 APC蛋白的结构特征  28-30
    4.3 APC基因家族的功能特征  30
    4.4 APC基因家族与Wnt/β-catenin信号通路  30-31
  5 脂肪组织源性间充质干细胞概述  31-34
    5.1 脂肪组织源性间充质干细胞的特征  31-32
    5.2 脂肪组织源性间充质干细胞的分化潜能  32-33
      5.2.1 成脂分化潜能  32
      5.2.2 成肌分化潜能  32-33
      5.2.3 成骨分化潜能  33
      5.2.4 其他类型细胞分化潜能  33
    5.3 脂肪组织源性间充质干细胞的应用  33-34
  6 多不饱和脂肪酸概述  34-36
    6.1 多不饱和脂肪酸的分类  34
    6.2 多不饱和脂肪酸的生物学功能  34-36
      6.2.1 多不饱和脂肪酸与脂肪代谢  34-35
      6.2.2 多不饱和脂肪酸与肿瘤形成  35-36
      6.2.3 不饱和脂肪酸与系统免疫  36
  7 研究的目的与意义  36-37
第二章 猪APC家族的分离克隆、生物信息学和组织表达分析  37-58
  1 前言  37
  2 试验材料和试剂  37-39
    2.1 试验材料  37-38
      2.1.1 试验动物  37
      2.1.2 组织样品  37-38
      2.1.3 载体和菌株  38
    2.2 试验主要试剂、仪器和主要溶液的配制  38-39
      2.2.1 主要试剂  38
      2.2.2 主要仪器  38
      2.2.3 主要溶液的配制  38-39
      2.2.4 主要分子生物学软件  39
      2.2.5 主要数据库  39
  3 试验方法  39-43
    3.1 猪APC1和APC2基因的分离克隆  39
    3.2 RT-PCR扩增目的基因  39-40
    3.3 PCR产物的回收与纯化  40
    3.4 载体连接  40
    3.5 转化连接产物  40
    3.6 阳性克隆的鉴定和测序  40
    3.7 猪APC基因家族的生物信息学分析  40-41
      3.7.1 猪APC基因家族的染色体定位  40-41
      3.7.2 猪APC基因家族的序列分析  41
      3.7.3 猪APC基因家族氨基酸序列多重比对和进化分析  41
    3.8 猪APC基因家族的组织表达分析  41-43
      3.8.1 组织样品总RNA的提取  41
      3.8.2 总RNA的纯化  41-42
      3.8.3 反转录合成cDNA的第一条链  42
      3.8.4 组织表达分析  42-43
  4 结果与分析  43-54
    4.1 猪APC基因家族的分离克隆与序列分析  43-45
    4.2 猪APC基因家族的生物信息学分析  45-53
      4.2.1 猪APC基因家族的染色体定位  45
      4.2.2 猪APC基因家族的氨基酸序列及其理化性质分析  45-53
    4.3 猪APC基因家族的组织表达分析  53-54
  5 讨论  54-58
    5.1 猪APC基因家族的分离克隆与序列分析  54-55
    5.2 猪APC基因家族的生物信息学分析  55-57
      5.2.1 染色体定位  55
      5.2.2 保守结构域的预测  55-56
      5.2.3 蛋白进化分析  56
      5.2.4 启动子分析  56-57
    5.3 组织表达分析  57-58
第三章 多不饱和脂肪酸对猪ADSCs中APC基因家族表达的影响  58-69
  1 前言  58
  2 试验材料和试剂  58-60
    2.1 试验材料  58-59
      2.1.1 试验动物  58
      2.1.2 试验器械  58-59
    2.2 试验主要试剂、仪器和主要溶液的配制  59-60
      2.2.1 主要试剂  59
      2.2.2 主要仪器  59
      2.2.3 主要溶液的配制  59-60
  3 试验方法  60-63
    3.1 猪ADSCs的分离培养  60-61
      3.1.1 猪ADSCs的分离  60
      3.1.2 猪ADSCs的传代培养  60
      3.1.3 猪ADSCs的冻存和复苏  60-61
    3.2 猪ADSCs的鉴定  61-62
      3.2.1 免疫组织化学  61
      3.2.2 分子生物学鉴定  61-62
    3.3 多不饱和脂肪酸的诱导处理  62
    3.4 细胞收集及总RNA的提取  62
    3.5 反转录合成cDNA的第一条链  62
    3.6 荧光定量PCR  62
      3.6.1 荧光定量PCR引物的设计  62
      3.6.2 定量PCR体系及扩增条件  62
    3.7 统计分析  62-63
  4 结果与分析  63-67
    4.1 猪ADSCs的分离培养  63-64
    4.2 猪ADSCs的鉴定  64-65
      4.2.1 免疫组织化学鉴定  64
      4.2.2 分子生物学鉴定  64-65
    4.3 多不饱和脂肪酸对猪ADSCs中APC基因家族表达的影响  65-67
      4.3.1 ω-3 PUFA对猪ADSCs中APC基因家族表达的影响  65-66
      4.3.2 ω-6 PUFA对猪ADSCs中APC基因家族表达的影响  66-67
  5 讨论  67-69
    5.1 猪ADSCs的分离培养  67
    5.2 猪ADSCs的鉴定  67
    5.3 多不饱和脂肪酸对猪ADSCs中APC基因家族表达的影响  67-69
第四章 猪APC基因家族在脂肪细胞分化过程的作用  69-80
  1 前言  69-70
  2 试验材料和试剂  70-71
    2.1 试验材料  70
      2.1.1 试验动物  70
      2.1.2 试验器械  70
    2.2 试验主要试剂、仪器和主要溶液的配制  70-71
      2.2.1 主要试剂  70
      2.2.2 主要仪器  70
      2.2.3 主要溶液的配制  70-71
  3 试验方法  71-73
    3.1 猪ADSCs细胞的分离培养  71
    3.2 猪ADSCs细胞的鉴定  71
    3.3 猪ADSCs诱导分化  71-72
    3.4 油红O染色  72
    3.5 细胞收集及总RNA的提取  72
    3.6 反转录合成cDNA的第一条链  72
    3.7 荧光定量PCR  72
      3.7.1 荧光定量PCR引物的设计  72
      3.7.2 定量PCR体系及扩增条件  72
    3.8 Western Blot  72-73
      3.8.1 细胞总蛋白提取  72-73
      3.8.2 SDS-PAGE电泳  73
      3.8.3 免疫印迹  73
    3.9 统计分析  73
  4 结果与分析  73-77
    4.1 猪ADSCs定向诱导分化为脂肪细胞  73-75
      4.1.1 形态学变化  73-74
      4.1.2 脂肪形成标志基因表达变化  74-75
    4.2 APC基因家族在脂肪细胞分化过程的作用  75-76
    4.3 Wnt/β-catenin信号通路相关基因在脂肪细胞分化过程中的表达  76-77
  5 讨论  77-80
    5.1 猪ADSCs定向诱导分化为脂肪细胞  77-78
    5.2 APC基因家族在脂肪细胞分化过程的作用  78-80
主要创新点  80
下一步工作计划  80-81
参考文献  81-91
附录  91-104
致谢  104

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