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CUEDC2的表达纯化与溶液结构初步探索

作　者: 张明
导　师: 颜贤忠
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析
关键词: CUEDC2 蛋白质表达纯化核磁共振溶液结构
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

CUEDC2 (CUE Domain Containing 2)是一个功能未知的蛋白质。最近研究发现CUEDC2能够和孕激素受体结合,促进孕激素诱导的受体的泛素化和降解,可能作为一个新的肿瘤治疗靶点,因而具有十分重要的应用价值。为了更好的研究其生物学功能,我们拟用核磁共振方法研究其三维结构。通过生物信息学的分析表明CUEDC2包含一个CUE结构域。CUE结构域是一个约40个氨基酸的广泛存在于真核蛋白质中的结构域。CUE结构域具有多种功能,其中包括内质网上所合成的折叠错误和序列错误的蛋白质的降解过程。CUE结构域有着与UBA结构域相似的结构,都有三个α-螺旋折叠而成。CUE结构域的α-螺旋1中的保守的MFP motif和α-螺旋3中的LL motif与泛素的疏水表面相互作用,同时据文献报道CUE结构域可以形成二聚体,可以附加的结合多个泛素,因而具有较高的泛素亲和能力。许多包含CUE结构域的蛋白质既能识别单泛素化又能识别多泛素化。实验证明,许多包含CUE结构域的蛋白质都能够以一种CUE结构域依赖性的方法发生泛素化。CUEDC2是一个分子量约为32 kDa包含287个氨基酸的酸性蛋白质。由于分子量较大,我们计划将其截成2个片段,分别解析其溶液结构。本文以CUEDC2为研究对象,分别构建了多个CUEDC2的截断体,并通过优化各种表达与纯化条件,获得了高表达的,且符合核磁共振实验要求的蛋白质样品溶液,并利用多维核磁共振技术对CUEDC2 N端包含133个氨基酸残基的结构域的溶液结构进行了初步的研究与探索。首先,我们表达、纯化了GST-CUEDC(1-133),但是在用凝血酶切除GST标签蛋白时,我们发现在用凝血酶酶切16小时后仍然无法将GST标签蛋白切下。于是我们考虑构建有较小的标签的克隆。我们将CUEDC2 N端的133个氨基酸构建到pET-28a载体上,并对其表达、纯化条件及蛋白质序列进行优化。最终获得了折叠状态较好的CUEDC(1-133)cut蛋白质样品。之后,我们优化了核磁共振的实验温度并确定了三共振实验条件。我们采集了一系列的三维核磁共振实验图谱,包括用于主链谱峰指认的HNCA、HNCOCA、CBCANH、CBCA(CO)NH和用于侧链谱峰指认的HBHA(CO)NH、CCCONH、15N-NOESY-HSQC、HCCH-COSY和HCCH-TOCSY谱。然后我们利用NMRPipe软件包对谱图进行处理,利用CARA软件归属了大部分主链原子的化学位移。本文还对CUEDC2(133-287)蛋白进行了初步的研究。表达、纯化了GST-CUEDC(133-287)。并利用凝血酶对GST-CUEDC(133-287)酶切,除去了GST标签蛋白,获得了高浓度的CUEDC(133-287)蛋白样品。然后我们1H核磁共振谱对其结构进行初步的评价。结果表明可能由于CUEDC2(133-287)这个截断体中缺失了某个关键的氨基酸序列,导致其折叠构象改变,蛋白质折叠不完全。我们希望通过构建其它的CUEDC2截断体来得到C末端折叠较好的CUEDC2蛋白,进行结构研究。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章前言  12-15
第二章核磁共振技术与蛋白质溶液结构的解析  15-30
  2.1 核磁共振三维结构研究的主要特征参数  15-16
    2.1.1 化学位移  15
    2.1.2 耦合常数  15-16
    2.1.3 核 Overhauser效应  16
  2.2 蛋白质溶液结构解析的核磁共振实验与化学位移归属  16-28
    2.2.1 蛋白质的表达纯化与用于核磁共振实验样品的制备  17-18
    2.2.2 NMR 实验数据的收集和谱图处理  18-25
      2.2.2.1 多维NMR 实验介绍  18-20
      2.2.2.2 谱图说明  20-24
      2.2.2.3 FID 信号的处理  24-25
    2.2.3 核磁共振信号的化学位移归属  25-28
      2.2.3.1 主链化学位移的归属  25-27
      2.2.3.2 侧链原子的化学位移归属  27-28
      2.2.3.3 二共振实验归属主链原子  28
      2.2.3.4 二共振实验归属侧链原子  28
  2.3 蛋白质溶液结构计算方法  28-30
第三章 CUEDC2 溶液结构初步探索  30-59
  第一节 CUEDC2 的研究背景  30-38
    3.1.1 CUEDC2 的介绍  30-34
      3.1.1.1 PR 的基本信息  30-32
      3.1.1.2 CUEDC2 与PR 的相互作用  32-34
    3.1.2 CUEDC2 的结构特点  34-37
    3.1.3 CUEDC2 结构研究目的与意义  37-38
  第二节核磁样品的制备和优化  38-51
    3.2.1 材料和方法  38
    3.2.2 CUEDC2(1-133aa) 的表达、纯化与分离与蛋白质序列优化  38-41
      3.2.2.1 诱导温度与诱导时间的优化  38
      3.2.2.2 加入诱导剂IPTG 浓度的优化  38-39
      3.2.2.3 融合蛋白质GST-CUEDC2(1-133aa)的表达  39
      3.2.2.4 融合蛋白质GST-CUEDC2(1-133aa) 的纯化  39
      3.2.2.5 CUEDC2(1-133aa) 重组质粒的构建  39-40
      3.2.2.6 融合蛋白质His-CUEDC2(1-133aa)的表达和纯化  40-41
      3.2.2.7 CUEDC2(1-133aa) 圆二色谱实验  41
      3.2.2.8 核磁共振所用标记蛋白的表达和纯化  41
      3.2.2.9 核磁共振样品制备  41
    3.2.3 结果  41-49
      3.2.3.1 CUEDC2 表达条件的优化的结果  41-43
      3.2.3.2 GST-CUEDC2(1-133aa)纯化与酶切反应结果  43-44
      3.2.3.3 His-CUEDC2(1-133aa)的纯化结果  44-45
      3.2.3.4 CUEDC2(1-133aa)圆二色谱实验结果  45-47
      3.2.3.5 CUEDC2(1-133aa)一维1H 实验和1H-15N HSQC 实验结果  47-49
    3.2.4 讨论  49-51
  第三节核磁共振实验条件优化及溶液结构初步探索  51-56
    3.3.1 CUEDC2(1-133aa)cut 蛋白质样品核磁共振实验条件优化  51-52
    3.3.2 CUEDC2(1-133aa)cut 的多为核磁共振实验与溶液结构初步探索  52-56
      3.3.2.1 核磁共振样品的制备  53
      3.3.2.2 多维核磁共振实验  53
      3.3.2.3 数据处理与谱峰归属  53-56
  第四节 CUEDC2(133-287aa)的表达、纯化以及结构生物学初步研究  56-59
    3.4.1 CUEDC2(133-287aa) 重组质粒的构建?  56
    3.4.2 GST-CUEDC2(133-287aa) 的表达与纯化  56-57
    3.4.3 结果与讨论  57-59
第四章总结与展望  59-60
参考文献  60-64
附录一  64-65
附录二  65-66
附录三  66-70
附录四  70-71
致谢  71

CUEDC2的表达纯化与溶液结构初步探索

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