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锌alpha-2糖蛋白调控脂肪细胞内甘油三酯代谢的研究

作　者: 尚明夏
导　师: 肖新华
学　校: 南华大学
专　业: 内分泌与代谢病学
关键词: 脂肪细胞锌α2糖蛋白脂肪分解线粒体
分类号: R589.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：构建小鼠锌α2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein)的重组真核表达载体，并稳定转染3T3-L1前脂肪细胞，研究锌α2糖蛋白(ZAG)调控脂肪细胞甘油三酯(ATG)代谢的作用及机制。方法：1、提取正常小鼠肝组织总的RNA，通过RT-PCR法扩增mZAG全基因表达序列，双酶切表达质粒pcDNA3.1(-)，将扩增后的mZAG全基因表达序列插入空质粒中，从而构建pcDNA3.1(-)-mZAG真核表达质粒，经PCR扩增方法和核苷酸测序验证后通过脂质体转染将pcDNA3.1(-)-mZAG序列转染至3T3-L1前脂肪细胞中，G418筛选稳定转染细胞株，Western Blot检测mZAG表达情况并检测激素敏感脂肪酶(HSL)、脂肪甘油三脂水解酶(ATGL)蛋白表达，RT-PCR检测HSL、ATGL mRNA表达，ELISA法测定脂肪细胞培养液上清中游离脂肪酸(FFA)浓度。2、体外培养3T3-L1前脂肪细胞，用含有胰岛素、IBMX与地塞米松的分化培养基诱导分化细胞，予以重组ZAG蛋白(20μg/mL)干预。采用油红O染色观察脂肪细胞内脂滴聚集、透射电镜扫描观察脂肪细胞线粒体数目变化及ELISA法测定脂肪细胞培养液上清中FFA浓度。结果：1、mZAG真核表达质粒pcDNA3.1(-)-mZAG经测序鉴定证实成功构建。2、过表达ZAG组的HSL、ATGL mRNA和蛋白表达水平高于未转染组和空白质粒转染组(P<0.05)。3、过表达ZAG组的细胞培养液上清中FFA水平与未转染组和空白质粒组相比无统计学差异(P>0.05)。4、重组ZAG蛋白干预分化成熟的脂肪细胞48h，细胞培养液上清中FFA浓度低于对照组，差异有显著性(P<0.05)。脂肪细胞内脂滴数量少、体积小，线粒体数量增多。结论：1、成功构建mZAG真核表达载体，建立ZAG稳定表达3T3-L1细胞系。2、ZAG过表达可上调脂肪分解酶ATGL和HSL的表达，促进脂肪分解。3、重组ZAG蛋白通过增加脂肪细胞内线粒体拷贝数促进脂肪分解。

锌alpha-2糖蛋白调控脂肪细胞内甘油三酯代谢的研究

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