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基于LDR-PCR通用寡核苷酸芯片同时检测十种马铃薯病毒研究

作　者: 汪平
导　师: 姜永厚
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 连接酶检测反应聚合酶链式反应通用寡核苷酸芯片多重性特异性灵敏性
分类号: S435.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

实验目的:在生物有机体检测中的靶标存在多样性、复杂性、物种组成以及特性的差异,因此建立一种统一的检测手段代替多个不同的专门方法就显得非常重要。本研究拟以苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus, AMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus, PLRV)、马铃薯A病毒(Potato Virus A, PVA)、马铃薯M病毒(Potato Virus M, PVM)、马铃薯S病毒(Potato Virus S, PVS)、马铃薯X病毒(Potato Virus X , PVX)、马铃薯Y病毒(Potato Virus Y, PVY)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus, TRSV)十种马铃薯病毒作为靶标对象,建立一种特异性强、灵敏度高、多重性好、通用性广可同时检测多种病原体的技术平台。实验方法:提取马铃薯病毒的总RNA,利用六聚体随机引物或特异性反向引物将RNA逆转录为cDNA,再利用特异性引物扩增每一种马铃薯病毒cDNA,并进行目标片段克隆和PCR电泳测序鉴定,经纯化含目标病毒保守片段的质粒作为检测系统优化的标准品。在每一种病毒的引物序列之间设计两条首尾相连的上、下游鉴别探针。上游鉴别探针序列3′端与上游通用序列的5′端相连组成上游LDR(Ligase detection reaction,连接酶检测反应)探针,同样用于基因芯片点制的Zip-code序列的5′和3′端分别与下游通用序列以及下游鉴别探针序列相连组成下游LDR探针。每种病毒的LDR探针在相应的靶序列存在且在Taq DNA连接酶作用下可连接形成100 bp左右的寡核苷酸产物。每种病毒的LDR连接产物都具有相同的通用序列和唯一对应的Zip-code序列。然后经通用引物不对称标记扩增,将连接扩增产物(含Zip-code互补序列)与基因芯片Zip-code序列进行杂交检测。在单病毒单重LDR-PCR基因芯片特异性检测的基础上,分别进行单病毒多重LDR-PCR优化实验,单种与两种混合病毒多重LDR-PCR基因芯片病毒特异性、灵敏度实验,十种病毒多重LDR-PCR基因芯片多重性实验,最后将建立的多重LDR-PCR基因芯片检测平台应用于田间样品检测。实验结果:主要有五个方面,①单病毒单重LDR-PCR电泳与芯片杂交检测表明设计的LDR探针具有非常高的检测特异性。②单病毒多重LDR-PCR体系的优化参数为:最适Taq DNA连接酶酶量为0.1 U,最适混合探针中每对探针分别为0.1 pmol,最适循环数为35个,最佳退火时间为4 min,最佳退火温度为58°C。③单病毒与两种混合病毒多重LDR-PCR基因芯片杂交检测具有较高的灵敏度,最低病毒检测量均为3 copies;检测体系具有较高的特异性,每一种病毒经反转录、LDR、PCR和芯片杂交后,仅在靶标位点产生强的荧光信号,而非靶标病毒则无阳性信号。④十种病毒多重LDR-PCR基因芯片杂交结果表明该方法检测的多重性好,可同时检测多种病毒。⑤应用多重LDR-PCR基因芯片检测79个田间样品,十种病毒的阳性检出率最低为2.53%,最高达到44.30%,高于普通PCR方法的阳性检出率(0-39.24%)。实验结论:本研究将多重LDR,PCR与通用寡核苷酸基因芯片技术结合,通过引入通用序列和Zip-code通用杂交序列,建立了一种特异性强、灵敏性高、多重性好、通用性广的可检测10种马铃薯病毒的检测技术,而且此技术还可用于临床、兽医、食品、生物安全、环境监测和基因诊断中基因遗传变异等领域。

基于LDR-PCR通用寡核苷酸芯片同时检测十种马铃薯病毒研究

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