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GPI-PLD基因对人肝癌细胞侵袭能力及血管生成拟态的影响

作　者: 朱旭锦
导　师: 唐建华
学　校: 中南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D 血管生成拟态 细胞侵袭 尿激酶型纤溶酶原激活物受体(CD87) Eph家族受体作用蛋白A1(Ephrin-A1)
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的通过提高GPI-PLD酶活性,增加细胞膜上GPI锚定蛋白质如CD87,ephrin-Al分子的释放数量,观察解锚定效应是否能够降低HepG2细胞的侵袭和肿瘤血管拟态生成的能力,为肿瘤治疗提出新的抗肿瘤转移和抗血管生成方案。方法用阳离子聚合物将本室已经构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞组、转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞组为对照,用G418筛选出阳性细胞克隆。RT-PCR法鉴定GPI-PLD基因的mRNA表达水平,利用自制的具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)做底物,定量检测GPI-PLD酶活性。ELISA检测各组细胞CD87的释放情况,流式细胞术检测细胞表面GPI锚定的CD87分子的变化；免疫细胞化学结合western blot鉴定ephrin-A 1的膜表面表达情况。以transwell方法检测CD87,ephrin-Al对HepG2细胞侵袭能力的影响；采用基质胶构建HepG2细胞株的三维培养模型,进行PAS染色观察是否形成血管样结构。结果RT-PCR法测定表明稳定转染GPI-PLD后,未转染组和转染空质粒组的GPI-PLD基因的mRNA表达水平明显低于GPI-PLD转染组的表达水平(P<0.05).GPI-PLD转染组细胞的GPI-PLD酶活性明显高于未转染组和转染空质粒组细胞的酶活性。GPI-PLD转染组的GPI-PLD活性达到14.24±6.27%,而其它组细胞GPI-PLD(?)舌性极低,分别为6.92±4.34%和8.36±5.63%,具有统计学意义(P<0.05)。ELISA法检测GPI-PLD转染组的CD87在培养基上清的浓度为4.18±0.95pg/ml,其他两组分别为1.48±0.76 pg/ml和1.84±0.63 pg/ml,差异有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞术分析各组细胞膜上GPI锚定的CD87分子均显阳性,但GPI—PLD转染组平均荧光强度的数值比其他两组要小。GPI-PLD转染组平均荧光强度为0.62±0.110,而其他两组分别为1.91±0.130和1.86±0.091,差异有显著性意义(P＜0.01)。免疫细胞化学、western-blot结果显示GPI—PLD转染组的ephrin-Al的表达量和其他两组相比明显减少(P<0.05).Transwell方法显示GPI-PLD的解锚定作用能减弱HepG2细胞的体外侵袭能力,GPI-PLD转染组侵袭力较未转染组和转染空质粒组分别降低30.6%、27.3%,统计有显著性差异(P<0.01)。HepG2细胞血管拟态三维培养结果观察,在接种后三天,未转染组和转染空质粒组呈现镶嵌样生长,出现网络样结构,而GPI-PLD转染组细胞均匀弥散生长；7天后,经PAS染色观察,未转染组和转染空质粒组可见明显的环状PAS阳性图案,而GPI-PLD转染组阳性图案不明显。结论稳定转染的GPI-PLD的HepG2细胞株能使GPI-PLD过度表达并使其GPI-PLD活性显著性增加。与此同时,细胞表面锚定的CD87、ephrin-Al的分子数量均显著减少。GPI-PLD可降低人肝癌HepG2细胞株细胞的体外侵袭能力和血管拟态生成能力,其机制与CD87、Ephrin-Al被GPI-PLD解锚定有关。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-11
缩略词汇表  11-12
前言  12-15
实验技术路线图  15-16
第一章 材料与方法  16-31
  1 材料  16-21
    1.1 细胞株、菌种和重组质粒  16
    1.2 主要试剂  16-20
    1.3 主要仪器  20-21
  2 方法  21-31
    2.1 携带pcDNA3.1(+)/GPI-PLD质粒的TG1大肠杆菌扩增培养及提取  21-22
    2.2 重组质粒pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转染HepG2细胞、筛选及鉴定  22-29
    2.3 转染的HepG2细胞体外侵袭能力的测定  29-30
    2.4 转染的HepG2细胞血管生成拟态的三维细胞培养与观察  30
    2.5 统计学分析  30-31
第二章 结果  31-44
  1. 质粒提取酶切结果  31
  2. 稳定转染GPI-PLD基因后G418筛选结果  31-33
  3. 经G481筛选稳定转染组及对照组细胞GIP-PLD酶活性测定结果  33-34
  4. 细胞总RNA提取及鉴定结果  34
  5. RT-PCR法检测GPI-PLD基因mRNA的表达量变化  34-35
  6. ELISA法检测各组细胞培养液中CD87的浓度  35-36
  7. 流式细胞术检测各组细胞表面锚定CD87的表达水平  36-38
  8. 免疫细胞化学法结合western blot检测各组细胞表面锚定Ephrin-A1的表达水平  38-40
  9. GPI-PLD对HepG_2细胞侵袭能力的影响  40-42
  10. 转染的HePG_2细胞血管生成拟态的三维细胞培养与观察  42-44
第三章 讨论  44-51
  1. GPI-PLD与肝细胞癌  44-46
  2. 肿瘤血管生成拟态  46-48
  3. CD87、Ephrin-A1与细胞侵袭、血管生成拟态  48-51
第四章 结论  51-52
参考文献  52-56
综述  56-63
  参考文献  61-63
致谢  63-64
攻读学位期间主要的研究成果  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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