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抗TNF-a×抗ED-B双功能抗体的构建及活性分析

作　者: 杨艳群
导　师: 杨艳燕; 刘梦元
学　校: 湖北大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 肿瘤坏死因子-α 双功能抗体原核表达免疫组化
分类号: R593.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节病变为主的全身自身免疫性疾病,主要表现为对称性、慢性、进行性多关节炎,关节滑膜的慢性炎症、增生,形成血管翳,最终导致关节畸形和功能丧失。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)参与RA滑膜组织增生、炎症和自身免疫反应等病理生理过程,是RA发病机制中居于中心位置的促炎性因子。TNF-α的拮抗剂已被证明是类风湿关节炎有效治疗剂。美国FDA已批准了Etanercept、Infliximab和Adalimumab这三种抗TNF-α的药物,其中后两种为抗TNF-α的单克隆抗体。这三种药物虽然在炎症关节局部起到治疗RA的作用,但同时也可能抑制机体其他组织和器官中的正常免疫反应,增大了微生物感染和肿瘤发生的几率。选择合适的靶向药物使药物选择性分布于RA炎性关节,降低或消除其对正常组织和关节的免疫抑制作用,能有效提高RA药物的治疗效果。人纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)有几种不同的亚型,分别是额外域A(Extra DomainA,ED-A)、额外域B(Extra Domain B, ED-B)、和Ⅲ型重复单位的连接片段(ⅢCS),其中,保留ED-B结构域的FN称为ED-B FN。近几年来累积的资料表明ED-B FN在RA患者的关节滑膜中呈现特异性的高表达,抗ED-B单抗在RA实验模型小鼠中进行靶向性作用研究发现能特异性定位于小鼠炎症关节,证实了ED-B作为靶向抗原的可行性。基于ED-B FN表达的组织特异性及其在肿瘤血管靶向治疗中所积累的资料来看,利用抗体靶向ED-B FN使药物选择性分布于RA炎性关节能有效提高治疗RA药物的靶向性,减少其对其他组织和器官的正常免疫抑制作用。本研究利用基因工程的方法构建抗TNF-α×抗ED-B双价双功能抗体原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)Star,利用0.5mM IPTG诱导目的基因表达,经SDS-PAGE(?)口Western-blotting分析目的蛋白的表达情况,双功能抗体主要以不可溶的包涵体形式在大肠杆菌中获得高效表达；利用超声破菌的方法制备包涵体蛋白,8M尿素溶解后通过Ni-NTA柱进行亲和层析纯化,并用缓慢透析除去变性剂的方法对包涵体蛋白进行复性,获得纯度在95%以上的可溶形式双功能抗体aEBTA;对其进行体外生物学活性分析,直接ELISA法检测双功能抗体aEBTA能特异性结合TNF-α; MTT法分析双功能抗体aEBTA中和TNF-α对小鼠成纤维细胞(L929)的细胞毒作用,50%抑制时的aEBTA浓度大约为5μg/ml(TNF-α杀伤浓度为1ng/ml)；免疫组化染色法检测aEBTA能有效与关节滑膜中ED-B的结合。本研究成功构建了抗TNF-α同时抗ED-B FN的双价双功能抗体,体外活性实验证明与两种抗原均有较好结合性,为在动物模型进行体内活性实验,考察药物治疗效果奠定了基础；利用双功能抗体在RA治疗上进行探索性研究,为RA的药物研究提出了新的思路。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
缩略语  9-12
第一部分绪论  12-23
  1.1 TNF-α的研究现状  12-16
    1.1.1 TNF-α的特性与结构  12-13
    1.1.2 TNF-α的生物学功能  13-14
    1.1.3 TNF-α在炎症性疾病中的作用  14
    1.1.4 TNF-α受体  14-15
    1.1.5 TNF-α及其受体在RA中的表达及作用  15-16
  1.2 抗TNF-α制剂治疗RA的现状  16-17
    1.2.1 Etanercept(依那西普)  16
    1.2.2 Infliximab(英夫利西)  16-17
    1.2.3 Adalimumab(阿达木)  17
  1.3 纤维连接蛋白结构域B(extra-domain B of fibronectin,ED-B)  17-20
    1.3.1 纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)  17-18
    1.3.2 ED-B结构  18-19
    1.3.3 ED-B分布、特性及应用  19-20
  1.4 双功能抗体及靶向治疗  20-21
  1.5 主要研究内容和意义  21-23
第二部分材料与方法  23-38
  2.1 材料  23-28
    2.1.1 质粒、菌株和细胞株  23
    2.1.2 引物  23-24
    2.1.3 工具酶及主要试剂  24
    2.1.4 主要溶液及其配制  24-27
    2.1.5 主要仪器设备  27-28
  2.2 方法  28-38
    2.2.1 TA克隆：T-aED-B,T-aTNF-α  28-30
    2.2.2 重组质粒pSM-aED-B的构建  30-31
    2.2.3 重组质粒pSM-aEBTA的构建  31
    2.2.4 大肠杆菌工程菌的构建及表达产物的鉴定  31-33
    2.2.5 双功能抗体aEBTA的纯化与复性  33-36
    2.2.6 双功能抗体aEBTA的活性分析  36-38
第三部分结果与分析  38-51
  3.1 TA克隆结果分析  38-40
    3.1.1 T-aED-B菌落PCR鉴定  38-39
    3.1.2 T-aTNF-α菌落PCR鉴定  39-40
  3.2 重组质粒pSM-aED-B鉴定  40-41
  3.3 重组质粒pSM-aEBTA鉴定  41-44
    3.3.1 重组质粒pSM-aEBTA菌落PCR鉴定  41
    3.3.2 重组质粒pSM-aEBTA酶切鉴定  41-42
    3.3.3 重组质粒pSM-aEBTA测序  42-44
  3.4 重组大肠杆菌表达产物的分析与鉴定  44-45
    3.4.1 表达产物aEBTA的SDS-PAGE分析  44
    3.4.2 表达产物aEBTA的Western Blotting鉴定  44-45
  3.5 双功能抗体aEBTA纯化与复性  45-47
    3.5.1 双功能抗体aEBTA纯化  45-46
    3.5.2 复性蛋白的超滤浓缩与浓度测定  46-47
  3.6 双功能抗体aEBTA的活性分析  47-51
    3.6.1 直接ELISA检测双功能抗体aEBTA与TNF-α结合  47
    3.6.2 MTT法检测双功能抗体aEBTA中和rhTNF-α对L929细胞的细胞毒作用  47-49
    3.6.3 免疫组化染色法检aEBTA与关节滑膜中ED-B的结合  49-51
第四部分总结与讨论  51-53
  4.1 总结  51
  4.2 讨论  51-53
参考文献  53-61
致谢  61

抗TNF-a×抗ED-B双功能抗体的构建及活性分析

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