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结核病血清学诊断试剂盒的研究

作　者: 阳幼荣
导　师: 王全立; 吴雪琼
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 结核分枝杆菌重组蛋白脂多糖酶联免疫吸附试验斑点免疫渗滤试验结核病
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：提取纯化结核分枝杆菌（MTB）特异性抗原，建立规范的MTB特异性抗体酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及斑点免疫渗滤试验(dot immunofiltration assay, DIGFA)检测系统。用建立的检测系统检测血清中的抗结核抗体，评价其在结核病（TB）血清学检测中的应用价值。方法：以实验室现有的重组MTB蛋白库为基础，表达纯化11种具用应用前景的MTB重组蛋白并提纯1种天然MTB脂多糖抗原（MTB-LPS）；分别确定各抗原最佳包被浓度和最佳第二抗体稀释度，建立规范的ELISA检测系统，用建立的ELISA检测系统检测192例结核血清，68例非TB患者血清，210例健康人血清共470份血清标本中的抗结核抗体水平，并比较在不同的阳性界值下各种抗原对TB检测的灵敏度及特异度的差别，以此筛选出敏感性好、特异度高、互补性强的抗原进行组合，并评价该组合在TB血清学诊断中的价值。以该抗原组合为基础建立胶体金免疫渗滤检测系统并对检测120例结核血清，60例非TB患者血清，60例健康人血清共240例血清标本进行检测，同时以目前已获得临床批文、国内应用广泛的MTB抗体胶体金法诊断试剂盒（上海奥普生物医药有限公司生产）作为参比试剂进行对比试验，评价该免疫胶体金渗滤试剂盒在TB诊断中的应用价值。结果：1、经亲和层析后得到了11种纯度较高的MTB重组蛋白，提纯的MTB脂多糖抗原未见核酸及蛋白残留。2、获得优化的ELISA检测条件：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgG最佳稀释度为1:10000，重组蛋白最佳包被浓度在1.6-6.3ug/ml之间，脂多糖抗原最佳包被浓度为0.16ug/ml。并应用ELSA检测系统检测了470例血清标本中抗结核抗体水平，以ROC曲线计算出最佳临界点作为界值，12种抗原的灵敏度分别为60.5%至82.9%，特异度分别为64.1%至92.7%；以x±3SD作为界值，12种抗原的灵敏度分别为13.3%至40.5%，特异度分别为96.4%至99.5%。3、各抗原之间存在一定的相关性和互补性，不能互相替代；将具有较强互补作用的r38kD、MTB-LPS、r16kD、rMPT63四种抗原进行组合过程中，随着组合抗原数的增多，检测灵敏度由29.0%提高至65.2%，特异度仅由96.9%降至90.0%。4、制备了以r38kD、MTB-LPS、r16kD、rMPT63四种抗原为基础的免疫胶体金渗滤试剂盒。240例血清标本的检测结果显示，本文制备的免疫胶体金渗滤试剂盒与MTB抗体胶体金法诊断试剂盒（上海奥普生物医药有限公司）相比，二者在肺结核组及健康对照组两个组别中的检测结果无显著性差别，但在非结核疾病组的检测中，本文的胶体金渗滤检测试剂盒要优于对照试剂盒。结论：1、成功地制备了12种用于TB血清学检测的抗原，并在此基础上成功地建立了ELISA和DIGFA检测系统。ROC曲线计算出最佳临界点作为界值各抗原的灵敏度较以x±3SD作为界值的灵敏度高，但特异性略低；由于各抗原在灵敏度及特异度上都存在着互补性，随着组合抗原的增加，检测灵敏度提高的同时，特异性会显著降低。因此，在组合抗原检测过程中，选择x±3SD作为界值更为适合。2、本文制备的胶体金检测试剂盒与传统的抗酸杆菌染色法(痰涂片法)相比，在灵敏度方面有明显的优势；与目前已获得临床批文、在国内广泛应用的MTB抗体胶体金法诊断试剂盒相比，在特异度方面明显优于对照试剂盒，灵敏度与对照试剂盒比较无显著性差别。

全文目录

英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-11
  参考文献  10-11
第一部分 MTB 脂多糖和重组蛋白抗原的制备  11-25
  一、材料与方法  11-17
  二、结果  17-21
  三、讨论  21-22
  四、参考文献  22-25
第二部分 12 种结核分枝杆菌抗原血清学诊断价值的研究  25-37
  一、材料与方法  25-29
  二、结果  29-30
  三、讨论  30-31
  四、参考文献  31-37
第三部分结核分枝杆菌四种抗原组合在免疫胶体金实验中的应用价值  37-43
  一、材料与方法  37-39
  二、结果  39-40
  三、讨论  40-41
  四、参考文献  41-43
研究结论  43-44
综述：结核分枝杆菌抗原及其在结核病免疫学诊断方面的应用  44-51
  参考文献  48-51
发表相关论文  51-63
个人简介  63-64
致谢  64

结核病血清学诊断试剂盒的研究

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