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急性肝损伤新型血清标志物BHMT的ELISA检测方法的建立及临床初探

作　者: 宁静
导　师: 陈建魁; 胡志远
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业:
关键词: BHMT ELISA 血清标志物 肝损伤
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


急性肝损伤是目前临床上导致死亡的重要原因之一，也是药物开发的主要障碍之一。检测肝损伤的指标虽然有很多报道，但临床常用的还是传统的谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST），碱性磷酸酶（ALP），γ-谷氨酰转肽酶（GGT）及胆红素（BIL）等。这些传统指标的敏感性及肝特异性差强人意，临床至今仍对高度敏感、特异的诊疗新指标有实际需求。因此，寻找更早期、更具肝特异性、更高灵敏性的急性肝损伤指标是本课题的研究目标。另外，近年来免疫学检测越来越普遍，而且向自动化、微型化、高通量的方向发展，已成为检验科最常用的检测方法。免疫学方法与生化酶学法相比，可以避免同工酶的干扰，特异性更好。但是传统的肝功检测几乎全部是基于生化酶学法，因此，发展一种基于免疫学的肝功检测方法也是本课题的研究重点。本实验室前期应用系统生物学手段和美国国立卫生研究院（NIH）的大规模平行测序（MPSS）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/）对人体和小鼠组织进行大规模高通量基因分析，获得这些组织的mRNA表达谱。根据其在肝脏和其他组织中转录物的表达量挑出133种待选肝特异性表达基因，并根据NCBI EST expression database，确定了其中107种更具肝特异性。后又依据其表达蛋白是否属于相似的蛋白家族进行排除，并利用过量扑热息痛（APAP）造成的小鼠肝急性损伤模型，对小鼠血清进行蛋白质组分析，如蛋白质谱，蛋白芯片以及免疫印迹等进行层层筛选，最终确定了其中的20种肝特异性基因的蛋白产物可以作为小鼠肝损伤的血清标志物。本研究在此基础上选择了上述蛋白之一的甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶—BHMT（betaine homocysteine S-methyltransferase）作为研究对象，发展了人血清BHMT的检测方法，并开展了初步的临床研究与探索。BHMT是一种含Zn2+的甲基转移酶，参与S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine SAH）及高半胱氨酸（homocysteine）的代谢调节。BHMT具有较高肝特异性，符合筛选肝特异性基因的标准：1)目的基因在肝脏中的表达量应是在其他非肝脏组织表达量的五倍以上，或是在其他非肝脏组织表达量总和的两倍以上；2)目的基因在肝脏中的表达量应大于10tpm（transcriptsper million）。而传统的肝功指标中ALT， AST， ALP， GGT均未能达到这个水平。此外，BHMT在大多数种属的肝脏中都有大量表达，约占肝脏可溶性蛋白总量的0.6～1.6%。因此BHMT具备了作为较好的急性肝损伤新型血清标志的重要特性。本实验室前期已制备并纯化了重组人BHMT在大肠杆菌BL21中表达的蛋白。并以此纯化蛋白为免疫原，获得了纯化的小鼠抗重组人BHMT单克隆抗体4D1和兔抗重组人BHMT多克隆抗体2-4-2。在这些工作的基础上，本研究又进行了更深入的探索，并已取得如下进展：1.获得了纯度较高的重组人BHMT真核表达蛋白。利用本实验室保存的含人BHMT全长序列的pGEX-4T1-BHMT为模板，扩增BHMT编码片段，将其插入实验室保存的真核表达载体pCMV-Flag，转染到293T细胞中，实现了重组人BHMT的真核表达。采用琼脂糖亲和介质（Ni）对该表达蛋白进行纯化，获得了纯度较高的重组人BHMT真核表达蛋白，可作为下步ELISA法定量检测人血清中BHMT含量的标准品。2.建立了检测人血清中BHMT的ELISA双抗夹心法。利用实验室前期制备的小鼠抗重组人BHMT单克隆抗体4D1，兔抗重组人BHMT多克隆抗体2-4-2和纯化重组人BHMT真核表达蛋白建立了检测人血清中BHMT的ELISA双抗夹心法。首先通过正交实验，优选出最佳实验体系，应用该实验体系进行ELISA检测。该方法的检测范围为0.82ng/ml～106.6ng/ml，可达到2个数量级，检测拟合曲线的线性相关系数可达0.999，并具有较好的准确性。3. BHMT的临床研究。用建立的ELISA法，检测临床血清样本中的BHMT含量，探索BHMT和急性肝损伤之间的关系。结果如下：（1）首先，建立了正常人血清中BHMT的95%医学参考值范围。检测了体检正常人血清样本200例，建立了人血清中BHMT的95%医学参考值范围为0～16.70ng/ml。（2）探讨BHMT和传统肝功指标ALT的相关性。检测了48例ALT>40U/L（目前ALT的医学参考值范围是0～40U/L）的可疑急性肝损伤住院病例血清中的BHMT含量。做统计学Spearman秩相关分析后，得出rs=0.74992，P<0.001，说明BHMT和ALT之间有较好的正相关关系。（3）评价BHMT判别肝损伤的诊断方法。检测126例临床样本，其中包括正常人和可疑急性肝损伤病例。以BHMT判别急性肝损伤的两种诊断方法：一种是血清中BHMT>33.39ng/ml（医学参考值上限的2倍）判别为急性肝损伤，另一种是血清中BHMT>50.1ng/m（l医学参考值上限的3倍）判别为急性肝损伤。两种诊断方法分别与目前临床传统的肝损伤诊断方法进行统计学Kappa一致性检验，使用单侧检验，得出以BHMT>33.39ng/ml判别急性肝损伤时，Kappa=0.7287，Z=8.29，P<0.001；以BHMT>50.10ng/ml判别急性肝损伤时，Kappa=0.8320，Z=9.38，P<0.001。由此可提示，两种BHMT判别急性肝损伤的诊断方法与传统标准均有较高的一致性，其中以BHMT>50.10ng/ml判别急性肝损伤的诊断方法与传统诊断标准的一致性更高。（4）确定BHMT诊断急性肝损伤的Cut-off值。以上述ELISA法检测的126份临床血清样本中的BHMT含量，和按目前临床诊断标准判别肝损伤是否为阳性，绘制ROC曲线，得出BHMT判别急性肝损伤的Cut-off值为65.92ng/ml，其灵敏度为0.94，特异度为0.94，准确度为0.94，约登指数为0.89。由此提示BHMT在诊断急性肝损伤中具有较高的诊断价值。（5）探讨BHMT在反映肝损伤方面的特异性。因BHMT也分布于肾脏，故采用ELISA法检测了20例肾损伤病例和20例正常人血清中的BHMT含量。将两组数据做统计学成组设计定量资料的Wilcoxon秩和检验，Z=－1.6167，P=0.1060>0.05，说明肾损伤病例和正常人血清中BHMT含量的差异无统计学意义，提示BHMT含量的变化可能与肾损伤无关，其反映肝损伤的特异性可能较好。（6）探讨BHMT在反映肝损伤方面的灵敏性。ELISA法检测5例急性肝损伤病例病程中血清BHMT含量的变化情况，绘制变化趋势图。5幅变化趋势图均可提示：在急性肝损伤的过程中，BHMT较ALT可能更灵敏些，BHMT达到高值的时间点更早，且升高的幅度更大；其回落速度更快。但受到临床检测样品数量的限制，上述结果是初步推测，还需后续更多的临床验证。以上研究结果提示，BHMT在诊断急性肝损伤的特异性及灵敏性方面均有较佳的表现，值得作为急性肝损伤血清标志物进行更深入的临床研究。

全文目录


英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-18
  一、肝脏损伤的原因  12-13
  二、肝损伤的相关机制  13-14
  三、目前肝损伤的检测指标  14-15
  四、目前常用急性肝损伤诊断指标存在的问题  15-16
  五、本研究的内容和意义  16-18
第一部分 重组人 BHMT 在 293T 细胞中的表达及纯化  18-35
  1 实验材料  18-20
    1.1 质粒和菌株  18
    1.2 主要试剂  18
    1.3 主要培养基和溶液的配制  18-19
    1.4 实验设备  19-20
  2 实验方法  20-29
    2.1 目的片段的扩增及鉴定  20-21
    2.2 pMD18-BHMT-His 的构建及鉴定  21-23
    2.3 pCMV-Flag-BHMT-His 的构建  23-24
    2.4 pCMV-Flag-BHMT-His 转染 293T 细胞的蛋白表达及表达产物的鉴定  24-26
    2.5 重组人 BHMT 真核表达载体的优选  26
    2.6 pCMV-Flag-BHMT-His 在 293T 细胞中的大量表达及纯化  26-29
  3 结果  29-33
    3.1 目的片段的扩增及鉴定  29
    3.2 pMD18-BHMT-His 的鉴定  29-30
    3.3 pCMV-Flag-BHMT-His 的鉴定  30
    3.4 pCMV-Flag-BHMT-His 转染 293T 细胞的蛋白表达与表达产物的鉴定  30-31
    3.5 重组人 BHMT 真核表达载体的优选  31-32
    3.6 真核细胞（293T）表达重组人 BHMT 蛋白的纯化  32-33
  4 讨论  33-34
  5 小结  34-35
第二部分 检测人血清中 BHMT 的 ELISA 法的建立及其在急性肝损伤中的临床应用  35-51
  1 材料  35-36
    1.1 标本来源  35
    1.2 主要试剂和耗材  35-36
    1.3 溶液的配制  36
    1.4 主要仪器设备  36
  2 检测人血清中 BHMT 的 ELISA 法的建立  36-38
    2.1 正交实验优选 ELISA 实验体系  36-37
    2.2 ELISA 法的基本步骤  37
    2.3 ELISA 法的 linearity-of-dilution 实验  37-38
  3 ELISA 法的临床应用  38-39
    3.1 建立人血清中 BHMT 的医学参考值范围  38
    3.2 探讨 BHMT 和 ALT 的相关性  38
    3.3 评价 BHMT 判别肝损伤的诊断方法  38-39
    3.4 确定 BHMT 用于诊断急性肝损伤的 Cut-off 值  39
    3.5 比较肾损伤病例与体检正常人血清中 BHMT 含量的差异  39
    3.6 分析五例急性肝损伤病例血清中 BHMT 含量随时间变化的趋势  39
  4 统计方法  39
  5 结果  39-48
    5.1 正交实验的结果  39-40
    5.2 ELISA 法检测范围的确立及检测曲线的拟合  40-41
    5.3 ELISA 法的 linearity-of-dilution 实验  41-42
    5.4 建立人血清中 BHMT 的 95%医学参考值范围  42
    5.5 探讨 BHMT 和 ALT 的相关性  42-44
    5.6 评价 BHMT 判别急性肝损伤的诊断方法  44-45
    5.7 确定 BHMT 用于诊断急性肝损伤的 Cut-off 值  45
    5.8 探讨 BHMT 在反映急性肝损伤方面的特异性  45
    5.9 探讨 BHMT 在反映急性肝损伤方面的灵敏性  45-48
  6 讨论  48-50
  7 小结  50-51
总结  51-52
参考文献  52-55
文献综述  55-57
代表性论著  57-60
个人简历  60
论文论文发表情况  60-61
致谢  61

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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