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报告基因标记的HCV长期表达小鼠模型的优化及在疫苗评价中的应用

作　者: 樊炜
导　师: 詹林盛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 丙型病毒性肝炎水动力转染优化的噬菌体整合酶 DNA疫苗
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

丙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病和多发病。丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染是造成慢性肝炎,肝硬化及肝癌的主要原因之一。长期以来,由于缺少有效的小动物模型,严重阻碍了HCV防治工作的进展,迄今尚无有效的治疗手段及预防性疫苗。因此建立具有实际应用价值的小动物模型,仍然是当今丙型肝炎防治研究的重大课题。本研究室在前期工作中,基于成年小鼠,联合应用水动力转染技术与噬菌体整合酶,初步建立了报告基因萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)标记的HCV全基因组小鼠体内表达模型,但小鼠体内HCV的表达水平、表达时间有待于进一步提高,模型的重复性、稳定性尚未评价。针对这一问题,本课题引进密码子优化的噬菌体整合酶,对目的基因在小鼠肝脏长期高效稳定表达的技术平台进行了优化,提高了外源基因在小鼠肝细胞中的整合效率。通过优化的技术平台,实现Fluc标记的HCV全基因组表达载体在成年小鼠肝脏染色体上的高效整合,延长了HCV在小鼠体内的表达时间、提高了表达量,并对模型的重复性、稳定性进行了评价,建立了HCV功能基因表达小鼠模型。该模型以Fluc作为HCV全基因组表达的内参,HCV功能基因的表达水平通过活体荧光成像对Fluc进行监测而得以反应。迄今为止,HCV全基因组已经在小鼠体内长期表达6个月以上。在此基础上,构建HCV NS3/4A DNA疫苗,以此模型为基础进行HCV NS3/4A DNA疫苗的评价,为疫苗开发提供实验基础。具体研究内容及结果如下:1.目的基因在小鼠肝脏长期高效稳定表达的技术平台的优化通过水动力转染法将带有噬菌体整合酶识别位点attB的Fluc表达载体pCI-attB-AATP -Fluc(pAA-Fluc)分别和噬菌体φC31整合酶表达载体(pCMV-int)以及密码子优化的噬菌体φC31整合酶表达载体(Pphic31φ)共转染至Balb/c小鼠体内,活体荧光成像技术连续监测Fluc的表达并对两组Fluc活性进行比较,发现共转染Pphic31φ组小鼠Fluc活性明显提高,表达时间更长,实现了对目的基因在小鼠肝脏长期高效稳定表达的技术平台的优化。2.Fluc标记的HCV全基因组小鼠体内长期表达模型的优化以上述技术平台为基础,通过水动力转染法将Fluc标记的HCV全基因组表达载体pCI-attB-AATP-Fluc-EMCV IRES-HCV(pAA-Fluc-IRES-HCV)及对照载体pAA-Fluc分别与Pphic31φ共转染至Balb/c小鼠体内。实验证实,在Pphic31φ作用下,HCV全基因组表达框架整合到小鼠肝脏第2号染色体的mpsL1位点,在小鼠肝脏获得稳定表达,长达180d。经反复实验证实,模型的稳定性好,重复性强。3.Fluc标记的HCV全基因组小鼠体内长期表达模型在疫苗评价中的应用为了验证模型在疫苗评价中的应用,我们构建了HCV NS3/4A DNA疫苗,以此模型为基础进行HCV NS3/4A DNA疫苗体内作用效果的评价。为此比较了下肢静脉水动力转染技术、电转染法两种免疫方式的转染效率,将pGL3-CMV分别通过下肢静脉水动力转染技术、电转染法转染肌肉组织,在不同时间点监测Fluc活性,发现下肢静脉水动力转染技术转染的肌肉组织Fluc的表达量更高,表达时间更长。因此本实验选择下肢静脉水动力转染技术作为免疫方式,以NS3/4A表达载体pVAX-NS3/4A为DNA疫苗免疫Balb/c小鼠,以pVAX作为对照,免疫两次后,水动力转染pAA-Fluc-IRES-HCV和Pphic31φ质粒,观察Fluc活性的变化。NS3/4A DNA疫苗免疫组,在建模后第5d开始监测到Fluc的下降,第9d出现明显统计学差异。上述结果初步表明NS3/4A疫苗促进了小鼠免疫系统对表达HCV的肝细胞的清除,推测可能是NS3/4A疫苗所激发的CTL反应对肝细胞的杀伤造成的,提示本模型可以用于疫苗评价。综上所述,运用密码子优化的噬菌体整合酶,优化了目的基因在小鼠肝脏长期高效稳定表达的技术平台,提高了Fluc标记的HCV全基因组在小鼠体内的表达水平,并对模型的重复性、稳定性进行了评价,建立了HCV全基因组长期表达小鼠模型。利用该模型对HCV疫苗进行初步评价,通过报告基因Fluc活性的高低反映HCV疫苗是否发生保护性作用,为HCV疫苗研究提供实验基础。

全文目录

缩略语索引  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-15
第一部分报告基因标记的HCV全基因组小鼠体内表达模型的优化  15-27
  1 实验材料  15-17
  2. 实验方法  17-20
  3. 实验结果  20-23
  4. 小结  23-25
  5. 讨论  25-27
第二部分报告基因标记的HCV全基因组小鼠体内表达模型在疫苗评价中的初步应用  27-37
  1. 实验材料  27-28
  2 实验方法  28-29
  3. 实验结果  29-34
  4. 小结  34-35
  5. 讨论  35-37
总结  37-39
参考文献  39-43
附录  43-53
个人简历  53-55
致谢  55-57
综述  57-62
  参考文献  60-62

报告基因标记的HCV长期表达小鼠模型的优化及在疫苗评价中的应用

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