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霍乱弧菌外膜蛋白W和U的克隆表达及抗原性研究

作　者: 李建华
导　师: 朱虹
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 霍乱弧菌外膜蛋白 W和U 抗原性胶体金免疫层析法
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

霍乱弧菌(vibrio cholerae)属于弧菌属,革兰氏阴性菌,是人类烈性肠道传染病霍乱的病原菌,若不及时救治死亡率高达50%以上。据报道全球每年由O1群和O139群引起200万霍乱病例,以亚洲、非洲和拉丁美洲流行较为严重,非O1和O139群是引起我国部分地区腹泻爆发流行的主要病原菌,因此检测霍乱弧菌是有效控制和防治该病的关键。霍乱弧菌检测方法很多,如分离培养法、血清学方法和PCR法等,但各有其无法避免的缺点而限制了推广使用。胶体金免疫标记技术是以胶体金为标记物,具有快速简便、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点,已广泛应用于医学、动植物检疫、食品安全监督等各领域。霍乱弧菌胶体金免疫层析检测试纸条国内外已有上市产品,但多采用霍乱弧菌多糖抗原制备检测用抗体,致使特异性减低或生产成本过高而不利于推广。外膜蛋白W(OmpW)和外膜蛋白U(OmpU)在霍乱弧菌的不同血清群中都存在,具有较好抗原性,机体感染霍乱弧菌后可产生OmpW和OmpU的特异性抗体。OmpW和OmpU是霍乱弧菌的潜在粘附因子,在细菌侵袭肠道过程中起一定作用,可能与细菌侵袭性和毒力有关。OmpW作为一种遗传保守、种特异性抗原,在霍乱弧菌不同血清群中均低水平表达,可以作为霍乱弧菌检测的候选靶点。OmpU是一种孔通道蛋白,功能与大肠杆菌外膜蛋白F(OmpF)相似,但核苷酸序列不具有同源性。OmpU占外膜蛋白总量的30%左右,含盐环境中可达到60%。本研究为国家传染病重大专项资助课题,利用基因工程技术获得霍乱弧菌重组蛋白OmpW和OmpU(r-OmpW和r-OmpU),制备多克隆抗体,期望该抗体能够用于霍乱弧菌的快速检测。研究内容和结果主要包括以下三个部分:一、库存霍乱弧菌的鉴定为保证研究所用的模板和检测靶标具有准确性,我们首先对库存的弧菌进行了系统鉴定。本实验首先将31株霍乱弧菌弧菌分别接种碱性蛋白胨水复苏培养6-8h后,吸取少量菌液接种胰酶大豆琼脂培养基培养12h,菌落呈圆形凸起、表面光滑、边缘整齐,革兰氏染色呈阴性,显微镜下观察可见菌体短小,稍弯曲呈弧状或逗点状,暗视野下呈流星样或穿梭状运动。在形态学鉴定基础上,应用API 20NE系统将31株弧菌进行生化鉴定,结果显示27株属于霍乱弧菌,而另外4株为其它弧菌。根据霍乱弧菌种特异性抗原ompW基因设计特异性引物,从基因水平鉴定霍乱弧菌,与API 20NE鉴定结果一致,显示机检的准确率高于手检。为确定霍乱弧菌的血清群及血清型,应用O1群多价诊断血清、O1群小川型诊断血清、O1群稻叶型诊断血清和O139群诊断血清进行血清学鉴定,结果此次鉴定的27株霍乱弧菌中,860064菌株、860065菌株、860066菌株、860067菌株、860068菌株、860069菌株、86006-10菌株和860120菌株属于O1群小川型;860071菌株、860072菌株、860075菌株、860077菌株、860081菌株、860082菌株、860083菌株、860101菌株、860112菌株、860118菌株和860121菌株属于O1群稻叶型;860091菌株、860106菌株和860111菌株属于O1群彦岛型;病人1菌株、环境2菌株和环境3菌株属于O139群;17015菌株和17018菌株属于非O1和O139群。二、霍乱弧菌OmpW和OmpU的原核表达及抗原性分析根据NCBI网站公布的霍乱弧菌ompW和ompU基因序列设计引物,以霍乱弧菌860069株基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(polymerse chain reaction, PCR)扩增得到除信号肽外的ompW核心序列和ompU基因序列。经1%琼脂糖凝胶电泳分析,PCR扩增产物片段大小约为588bp和1026bp,与预期大小一致。将目的片段与克隆载体pMD18-T连接,分别构建了重组质粒pMD18-T-ompW和pMD18-T-ompU,转化至JM109感受态细胞,获得含有目的基因序列的克隆菌株。该菌株经PCR鉴定后,提取阳性重组克隆质粒,经限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切后回收目的条带,将其与相同双酶切后的表达载体pET32a连接,构建重组表达质粒pET32a-ompW和pET32a-ompU,转化至BL21(DE3)感受态细胞。经PCR和双酶切鉴定,阳性菌株经测序后,利用NCBI BLAST序列比对分析相似性均为99%,开放读码框正确,保证了r-OmpW和r-OmpU一级结构的准确性。由于融合了硫氧还蛋白,得到的r-OmpW和r-OmpU的分子量分别为41kDa和57kDa。SDS-PAGE分析显示r-OmpW和r-OmpU在37℃诱导5h时表达量最大,约占全部菌体蛋白的53%和57%。将诱导菌体超生破碎,发现r-OmpW和r-OmpU均以包涵体形式高效表达。经尿素变性及梯度透析复性纯化后,纯度均在90%以上。Western Blot结果表明:r-OmpW和r-OmpU能和霍乱弧菌免疫兔血清反应,具有较好抗原性。纯化的r-OmpW和r-OmpU蛋白按常规方法免疫新西兰大耳白兔,双向琼脂糖检测抗体效价可达1:32。Western Blot结果显示OmpW和OmpU多克隆抗体均能与O1群古典型和EL Tor型、O139群霍乱弧菌特异性结合,可进一步用于检测霍乱弧菌。三、霍乱弧菌rOmpW和rOmpU抗体在胶体金免疫层析检测中的初步应用本研究利用柠檬酸三钠还原法制备直径约为25-30nm的胶体金颗粒,分别标记rOmpW和rOmpU抗体,优化标记条件,确定稳定胶体金最适抗体浓度为30μg/ml,最佳标记pH值为9.0,得到的金标探针在520nm处的A值分别为3.51和4.05,在适宜的A值(2.5~10)范围内,符合设计要求。应用rOmpW和rOmpU抗体包被硝酸纤维素膜的最适浓度均为4mg/ml。霍乱弧菌rOmpW和rOmpU抗体在胶体金免疫层析的初步应用结果显示:2种抗体对27株霍乱弧菌检测均为阳性,最低检测浓度均为均为1.8×10~8cfu/ml。结果还显示2种抗体胶体金试纸条均发生交叉反应,其中,rOmpW抗体的试纸条与副溶血性弧菌860160菌株发生交叉反应,rOmpU抗体的试纸条与创伤弧菌870101菌株和副溶血性弧菌860160菌株发生交叉反应,可能与弧菌属部分菌株的氨基酸序列之间具有同源性有关,有待于进一步研究验证。

全文目录

英文缩略词表  6-7
摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-16
第一部分库存霍乱弧菌的鉴定  16-23
  1 材料与方法  16-19
    1.1 材料  16-17
    1.2 方法  17-19
  2 结果  19-22
    2.1 细菌形态学鉴定  19
    2.2 API 20NE系统鉴定  19-20
    2.3 PCR鉴定  20-21
    2.4 血清学鉴定  21-22
  3 讨论  22-23
第二部分霍乱弧菌外膜蛋白 W和U的克隆表达  23-50
  1 材料和方法  23-38
    1.1 材料  23-29
    1.2 方法  29-38
  2 结果  38-48
    2.1 目的基因的PCR扩增  38-39
    2.2 克隆菌株的鉴定结果  39-40
    2.3 表达工程菌株的鉴定结果  40-42
    2.4 rOmpW和rOmpU的诱导表达及纯化  42-45
    2.5 r-OmpW和r-OmpU的抗原性分析  45-46
    2.6 兔抗rOmpW和rOmpU多克隆抗体的鉴定  46-48
  3 讨论  48-50
第三部分 rOmpW和rOmpU多克隆抗体在胶体金免疫层析检测中的应用  50-59
  1 材料与方法  50-55
    1.1 材料  50-52
    1.2 方法  52-55
  2 结果  55-57
    2.1 稳定胶体金最适的rOmpW和rOmpU抗体剂量及最适pH值  55-56
    2.2 胶体金标记rOmpW和rOmpU抗体探针的浓度检定  56
    2.3 致敏硝酸纤维素膜的rOmpW和rOmpU抗体最适浓度  56
    2.4 rOmpW和rOmpU抗体免疫胶体金试纸条的检测效果观察  56-57
  3 讨论  57-59
结论  59-60
参考文献  60-62
文献综述  62-69
  参考文献  66-69
发表论文  69-77
个人简历  77-78
致谢  78

霍乱弧菌外膜蛋白W和U的克隆表达及抗原性研究

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