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抗原性相同而免疫原性差异显著的两个蛋白对T、B细胞的激活作用研究

作　者: 伍小路
导　师: 罗文新；吴婷
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 戊型肝炎病毒颗粒性抗原疫苗 T细胞表位免疫原性抗原性
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白ORF2的aa394-606片段NE2可以体外形成同源多聚体,其N端延伸突变体HEV 239蛋白(ORF2 aa368-606)在体外可以自发组装成类病毒颗粒。二者具有近乎完全一致的抗原性,但HEV 239的免疫原性比可溶的非颗粒蛋白NE2强200倍左右。有研究表明,颗粒蛋白抗原比可溶性抗原能够更加有效的被抗原递呈细胞捕获从而具有更强的免疫原性,亦有文献报道认为,这是由于颗粒抗原能更有效的激活B细胞。因此对HEV 239与NE2的研究将能使我们更好的了解颗粒抗原与可溶性抗原免疫原性差别产生的原因,并为将来合理的设计开发基因工程亚单位疫苗提供新的思路。本文第一部分研究了239蛋白与NE2蛋白诱导机体产生T细胞免疫应答的能力。用铝佐剂吸附的239蛋白与NE2蛋白皮下免疫BALB/c小鼠,免疫两周后取其脾细胞,用IL-5-ELISPOT与IFN-γ-ELISPOT方法来测定脾细胞中抗原特异性T细胞数量与类型。结果发现,239比NE2能激活更强的Th1与Th2应答,这可能是NE2蛋白免疫原性较弱的原因之一。本文第二部分利用覆盖HEV 239蛋白全长的15AA肽库(相邻肽段重叠10AA)做为IFN-γ-ELISPOT实验中的刺激原初步筛选HEV 239蛋白的H-2~d限制的T细胞表位。结果显示肽段P34(序列:HSKTFFVLPLRGKLS)有较强的反应性而P35(:序列FVLPLRGKLSFWEAG)有中等强度的反应,其他肽段无反应。对P34与P35肽中所含T细胞表型的进一步研究发现肽P34为优势Th表位肽而肽P35包含一较弱CTL表位和来自P34肽的部分Th表位活性。本文第三部分用IFN-γ-ELISPOT实验来定量分析不同浓度的239与NE2蛋白体外激活P34-CFA免疫小鼠脾细胞的能力。结果发现,高浓度的239与NE2都能激活P34特异的T细胞,而在低浓度抗原的情况下,239仍能诱导T细胞应答而NE2不能。实验结果说明,只有高浓度的NE2才能激活T细胞应答,而在疫苗免疫的过程中无法实现高的局部抗原浓度,因此NE2很难有效的激活T细胞应答。而为了验证激活Th细胞能力对于NE2蛋白免疫原性的影响,用P34,P35与P18(阴性对照)CFA初免小鼠后再腹腔加强5,10,20μg铝佐剂吸附的NE2蛋白,并对免疫后三周的小鼠血清中抗HEV抗体的进行检测,实验结果显示P34、P35均对NE2有初免效果,能帮助此剂量的NE2产生抗体应答,但P34的效果比P35强,而P18无初免效果。但是P34初免NE2加强的抗体反应仍弱于低剂量239蛋白诱导的抗体反应。这说明不能有效激活T细胞是NE2抗原性较弱的原因,但不是唯一原因。本研究的第四部分主要比较NE2与239蛋白活化B细胞能力的差异,将0.2,2,20,100μg铝佐剂吸附的HEV 239与NE2蛋白腹腔免疫Balb/c裸鼠,每组三只,检测免疫后第7天与第14天裸鼠血清中抗HEV抗体。结果发现仅0.2μgHEV 239就能诱导非T细胞依赖的抗体应答,而100μg的NE2蛋白仍无法诱导可检出的非T细胞依赖的抗体应答。这说明活化naive B细胞的能力不同也有可能是NE2与239具有相同的抗原性但不同免疫性的原因之一。最后,本文的第五部分主要将前面实验获得的H-2~d限制的Th表位应用于单克隆抗体的生产,对一无法利用基因工程技术表达的禽流感抗原,化学合成包含其B细胞表位与本研究获得的H-2~d限制的Th表位的肽段,将此肽段与CFA混合后免疫小鼠,最后我们获得了一株B表位特异的单克隆抗体。总之,本研究精确定位了HEV 239蛋白的H-2~d限制的Th表位与CTL表位,初步的阐明造成颗粒性抗原与可溶性抗原免疫原性差别的原因,为今后疫苗的研究开发提供了新的思路。最后,利用实验中获得的Th表位协助一B表位获得表位特异的单克隆抗体。

全文目录

缩略词  8-10
摘要  10-12
Abstract  12-15
第一章前言  15-43
  一戊型肝炎病毒与疫苗研究  15-22
    1 戊型肝炎的流行及其危害  15-16
    2 戊型肝炎病毒  16-19
    3 国内外戊型肝炎疫苗研究进展  19-20
    4 本实验室戊型肝炎疫苗研究  20-22
  二 T细胞表位与功能  22-28
  三 T细胞表位的筛选与鉴定  28-37
  四抗原类型与免疫应答  37-41
  五本研究的目的与意义  41-43
第二章材料与方法  43-57
  一材料  43-48
  二方法  48-57
第三章结果与分析  57-78
  一 HEV 239与NE2激活小鼠T细胞免疫水平差别  57-58
  二 HEV 239 H-2~d限制性T表位筛选与鉴定  58-70
  三激活T细胞应答能力与其对NE2免疫原性的影响  70-74
  四 HEV 239与NE2激活B细胞能力的差别  74-76
  五 HEv239蛋白H-2~d限制性的Th表位在单克隆抗体筛选中的应用  76-78
第四章问题与讨论  78-83
  一 HEV 239与NE2蛋白免疫原性差别的原因  78-79
  二 15肽T表位可激活抗原特异性CD8~+T细胞  79-81
  三 Th细胞的分化与可塑性  81-83
小结与展望  83-84
  综合前面所述,本论文研究获得以下结果  83
  下一步工作展望  83-84
参考文献  84-102
致谢  102-103
在学期间发表的论文  103

抗原性相同而免疫原性差异显著的两个蛋白对T、B细胞的激活作用研究

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