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组蛋白去乙酰化酶抑制剂拮抗程序性坏死的分子机制探讨

作　者: 王迪
导　师: 于晓妉
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: HDAC 抑制剂 SAHA L929 细胞细胞程序性坏死 TNFα RIP1
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

细胞凋亡是一种主动的细胞死亡方式，因其发生受到一系列基因的调控，因此又被称为程序性死亡（programmed cell death，PCD）；在过去相当长的一段时间里，细胞凋亡几乎是细胞程序性死亡的代名词。而细胞坏死则被认为是一种不可调控的被动的细胞死亡，因而有关细胞坏死的调控机制研究被忽视。近年来的研究进展发现，在某些死亡受体介导的诱发细胞凋亡的体系中，如果采用caspase抑制剂zVAD-fmk阻断caspase的活化，细胞则不会发生凋亡，但却转而发生细胞坏死，这种坏死被描述为Necroptosis。尽管在形态学上，Necroptosis与细胞受到意外强烈打击时发生的细胞坏死没有区别，但越来越多的研究证明Necroptosis的发生受多种基因调控，因此同样隶属于程序性死亡，即细胞程序性坏死（以下简称坏死）。在以肿瘤坏死因子（TNFα）介导的细胞坏死的系列研究中，激酶RIPK1和RIPK3蛋白及其激酶活性被证实是参与坏死调节的关键，一类小分子化合物Necrostatins可以通过抑制RIPK1的激酶活性而拮抗细胞坏死。在坏死诱导发生后，RIPK1、RIPK3、caspase-8和FADD形成坏死复合体，该复合体中RIPK1和RIPK3均处于磷酸化修饰状态，且二者的结合对该复合体的形成是必须的。此外研究证实，FLIPL作为细胞坏死的负调控蛋白，与FADD和Caspase-8形成复合体，在胚胎发育和T淋巴细胞的活化过程中，参与对细胞坏死的拮抗作用。近期研究发现，RIP3通过其下游蛋白MLKL和PGAM5形成线粒体攻击复合体，传递信号至线粒体并通过线粒体分裂蛋白Drp-1诱导细胞坏死。与细胞凋亡的研究相比，目前对细胞坏死的调控机理尚了解甚少，深入探讨其分子机制无疑具有重要的科学意义。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂是一类重要的表观调控药物，因其具有高效低毒的的特点，已经成为重要的新型抗肿瘤治疗药物，其中Vorinostat（SAHA）已经通过美国FAD批准用于表皮T细胞淋巴瘤临床治疗，其他多种选择性HDAC抑制剂也都进入Ⅰ期或Ⅱ期的临床试验中。HDAC抑制剂可以有效地提高细胞中组蛋白的乙酰化水平，诱导基因活化，阻断细胞周期，导致细胞生长抑制和/或细胞凋亡，从而达到其抗肿瘤的目的。近年来的研究还证实HDAC抑制剂还具有抗炎活性，此外，与HDAC抑制剂可诱导肿瘤细胞凋亡的作用相反，在动物创伤性脑损伤模型、缺血-再灌流引发的氧化-损伤模型、心衰模型、脓毒血症引发的肝细胞损伤模型等，HDAC抑制剂均显示了其保护细胞、拮抗细胞死亡的作用。因此对HDAC抑制剂作用机理的深入探讨，将有助于我们进一步挖掘其在多种疾病治疗方面的应用价值。在本研究中，我们采用经典的TNFα介导小鼠纤维肉瘤L929细胞坏死模型，探讨了HDAC抑制剂对TNFα介导细胞坏死的拮抗作用。我们的研究结果表明，多种HDAC抑制剂均能够不同程度的拮抗TNFα介导的细胞坏死，以SAHA为代表的深入研究显示较低的药物浓度（1μM）就表现出较好的细胞坏死拮抗效果，而在该低剂量下，SAHA对p21的表达没有显著影响，也不能诱导细胞周期抑制及细胞凋亡，提示SAHA的保护作用与上述已知细胞效应的调控机制无关。由于SAHA的细胞坏死拮抗作用与预先处理细胞的时间呈正相关，提示SAHA可能通过表观遗传调控改变了部分基因和蛋白的表达。我们对TNFα信号复合体的不同蛋白进行了检测，结果表明SAHA可以剂量依赖地下调多种蛋白的表达，包括RIP1、TRAF2、cIAPs、A20及CYLD，同时可以上调FLIPL的表达。由于在1μM作用浓度下，SAHA下调蛋白表达的作用不明显，但却可以时间依赖地上调FLIPL的表达，提示SAHA可能通过上调FLIPL的表达，抑制形成RIP1/FADD/Casp-8组成的Ripoptosome复合体，从而拮抗细胞坏死。相关敲低FLIPL表达及Ripoptosome复合体的检测实验尚在进行中。在对TNFα介导的相关信号通路检测中，我们还发现SAHA对多条信号通路具有重要的调节作用，包括增强NFκB和p38MAPK的活化及阻断JNK通路的持续性活化和Akt激酶的内在性活化。通过采用不同信号通路的特异性抑制剂，验证了SAHA对上述信号通路的调控均在其发挥细胞保护作用过程中起到重要的作用。值得注意的是采用Rapamycin阻断mTOR激酶活性启动细胞自噬同样可以拮抗细胞坏死，提示SAHA通过灭活Akt激酶活性启动自噬也是其拮抗细胞坏死的重要环节。通过siRNA技术敲低RIPK1激酶的表达，我们注意到SAHA的保护作用丧失，而SAHA对相关信号通路的调节也受到很大影响，提示对RIPK1激酶介导信号传递的不同调节是SAHA发挥其拮抗细胞坏死的重要分子机制。结论SAHA可以通过上调FLIPL的表达，促进p38-NFκB信号通路活化，抑制持续性JNK和Akt通路活化，启动细胞自噬等多方位的作用方式拮抗TNFα介导的细胞坏死。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-19
第一部分组蛋白去乙酰化酶抑制剂 SAHA 对细胞程序性坏死的拮抗作用  19-32
  1、材料和方法  19-23
  2、实验结果  23-30
  3、讨论  30-32
第二部分组蛋白去乙酰化酶抑制剂 SAHA 拮抗细胞坏死的分子机制探讨  32-56
  1、材料和方法  33-38
  2、实验结果  38-52
  3、讨论  52-56
结论  56-57
参考文献  57-63
文献综述  63-73
  参考文献  70-73
个人简历  73-74
附录  74-77
致谢  77

组蛋白去乙酰化酶抑制剂拮抗程序性坏死的分子机制探讨

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