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磷钼杂多酸罂粟碱复合物散射定磷法及其应用

作　者: 张奕
导　师: 杨晓兰
学　校: 重庆医科大学
专　业: 药物化学
关键词: 磷钼杂多酸光散射 PDE4B 抑制剂
分类号: R927.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

无机磷可与钼酸铵和罂粟碱通过分子自组装方式形成粒子复合物，该复合物具有特殊的散射光信号，其与无机磷具有良好线性关系。利用这一性质，可实现无机磷含量的测定，此散射定磷法可用于涉及无机磷释放的酶抑制剂的筛选。本文以磷酸二酯酶4（PDE4B）为酶模型，通过PDE4B与碱性磷酸酶偶联，水解环磷酸腺苷释放无机磷，应用散射定磷法测定碱性磷酸酶和磷酸二酯酶4的活性，从而测定抑制剂的抑制效应。基于这样的酶动力学过程，可建立筛选PDE4B抑制剂的光谱学模型。1.光散射测定无机磷方法的建立在强酸条件下,磷酸根负离子与钼酸根负离子可形成磷钼杂多阴离子。在均相溶液中，该阴离子与生物碱等正电荷粒子由于静电的相互作用，能形成稳定的离子复合物，该离子复合物具有较强的散射光信号。通过对该复合物在200nm-700nm的散射光进行扫描，我们获得了最大散射光的峰值为392nm。通过化学计算，预设无机磷含量的条件下测定该复合物的散射信号。该散射信号在一定无机磷浓度范围内，满足线性响应关系。根据这一特殊光谱学数据，我们尝试建立利用散射光信号测定无机磷含量的方法。首先，利用紫外分光光度计对复合物进行了紫外光谱进行800-200nm全波段扫描，比较各个组分紫外光谱信号的差异。根据这些扫描数据的差异，同时与共振散射光谱比较，我们发现复合物的紫外吸收光谱与散射光谱并不靠近或重叠，根据这一现象我们推断复合物为具有较大颗粒粒径的有机-无机复合粒子，利用荧光显微镜和激光粒径测量技术，作者对粒子微观形态进行了系统的观察，该粒子粒径在微米级，因此该粒子所产生的散射不一定就是共振瑞利散射，应该是Mie散射。通过对影响光信号强弱的测定体系各个组分进行了优化设计和比较实验，考察了测定体系的关键影响因素，包括测定体系的酸度、甘油用量、PVA用量等。结合瓦里安荧光分光光度计的动力学扫描功能，对复合物的形成过程进行了跟踪。由此获得优化的测定条件，包括复合物达到稳态所需时间、信号的稳定性、及影响稳定性的各组分组成比例。在此优化的测定体系下，无机磷含量的可测线性范围为0.5-20uM。同时，三组分复合时，加样方式不同测定结果不同。A方式为先加钼酸铵后加罂粟碱；B方式相反。测定结果表明，加样方式B明显比加样方式A优越，并且加样方式B的抗生物碱硫酸奎宁、抑制剂等的干扰能力明显比加样方式A强。其机理有待于进一步考察。本项目优选加样方式B，并将此优化的散射定磷法应用于酶抑制剂筛选。2.散射定磷法测定CIAP和PDE4B活性首先利用碱性磷酸酶水解单磷酸腺苷为基础，验证了该方法测定酶活性的可行性和可靠性。在此基础上，选择磷酸二酯酶为药物靶蛋白，进行酶抑制剂筛选。用磷酸二酯酶水解环磷酸腺苷二酯键，再用碱性磷酸酶水解其产物单磷酸腺苷释放无机磷，因此将两种酶偶联，利用散射光测两酶偶联所释放无机磷的含量。从而计算碱性磷酸酶和磷酸二酯酶4活性。实验结果表明，在一定碱性磷酸酶含量范围内，散射信号表现较好的线性关系，重复性和可操作性均较理想。3. CIAP和PDE4B抑制剂的筛选在测定两种酶的活性的基础上，建立光散射技术定磷法筛选磷酸二酯酶（PDE4B）生物碱类抑制剂和牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)联苯胺抑制剂的方法，初步评价了抑制剂的抑制效应。对碱性磷酸酶，联苯胺抑制效应在0-10uM范围内满足线性关系，对磷酸二酯酶，咯利普兰，罂粟碱，硫酸奎宁，茶碱均表现了不同程度的抑制效应。咯利普兰（rolipram）的抑制效应与文献所报道一致。综上所述，本课题建立了稳定可靠的磷钼杂多酸罂粟碱复合物光散射定磷的方法，并通过改变加样方式获得了较为理想的测定方法。将其应用于测定PDE4B及CIAP偶联酶活性以筛选其抑制剂，从而为我们建立散射定磷法筛选酶抑制剂技术平台奠定了基础。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-6
摘要  6-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-17
  1. UV-VIS 定磷法及应用  12
  2 散射光定磷法  12-14
  参考文献  14-17
第一部分散射光测定无机磷方法的建立  17-42
  1 实验材料  17-18
  2 实验方法  18-24
  3 结果  24-39
  4 讨论  39-40
  5 小结  40
  参考文献  40-42
第二部分光散射法测定 CIAP 和 PDE4B 活性  42-48
  1.实验材料  42
  2.实验方法  42-43
  3 结果  43-45
  4 讨论  45
  5 小结  45-46
  参考文献  46-48
第三部分 CIAP 和 PDE4B 抑制剂的筛选  48-55
  1 实验材料  48
  2 实验方法  48-50
  3 结果  50-51
  4 讨论  51
  5 小结  51
  参考文献  51-55
全文总结  55-56
致谢  56-57
攻读硕士学位期间发表的论文  57-58

磷钼杂多酸罂粟碱复合物散射定磷法及其应用

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