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重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶蛋白的研制

作　者: 商艳芬
导　师: 钱令嘉
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: rhBHMT 表达纯化 HCY 高同型半胱氨酸血症
分类号: R34
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:建立一种制备重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(recombinant human betaine-homocysteine S-methyltransferase,rhBHMT)药用蛋白的生物工程技术,获得高纯度并具有稳定生物学活性的rhBHMT药用蛋白,确认其防治高同型半胱氨酸血症的药效学作用。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得rhBHMT基因;采用大肠杆菌BL21作为原核表达系统对rhBHMT蛋白进行诱导表达,构建和筛选rhBHMT蛋白高效和可溶性表达的工程菌株。采用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱和CM阳离子层析柱对原核表达的rhBHMT蛋白进行纯化,应用SDS-PAGE、HPLC、Lowry法等试验对所得蛋白进行相对分子质量、纯度、浓度、蛋白含量分析,建立硝普钠显色法对rhBHMT蛋白的活性进行检测。以束缚应激和高蛋氨酸饮食干预两种方式建立高同型半胱氨酸血症Wistar大鼠模型,给予高同型半胱氨酸血症大鼠以不同剂量的rhBHMT蛋白,观测对其血浆HCY水平的影响,研究rhBHMT治疗高同型半胱氨酸血症的生物学作用。结果:构建了rhBHMT高效、可溶性表达的工程菌株,通过上述生物工程技术系统分离纯化其表达产物,获得了纯度达95 %以上的rhBHMT蛋白。所得蛋白含量为0.01-1.0 mg/ml,相对分子质量约为43kb,在20mmol/L PH7.0的磷酸钠缓冲液中可稳定储存于-20℃条件下。建立了用于检测rhBHMT酶活性的硝普钠显色法,其操作简便、重复性及稳定性好,与氨基酸测定仪检测结果比对的一致性好。以此硝普钠显色法测定该rhBHMT蛋白样品活性约为70 U/mg。给予束缚应激和高蛋氨酸饮食所诱导的高同型半胱氨酸血症大鼠rhBHMT,可以显著降低大鼠血浆同型半胱氨酸水平,且具有明确的剂量效应。结论:应用生物工程技术,构建了rhBHMT稳定高表达的工程菌株,建立了对表达产物中rhBHMT蛋白的分离纯化工艺,制备了高度纯化蛋白rhBHMT,完成了其重要的理化性质和活性的鉴定,确认了rhBHMT降低高同型半胱氨酸血症大鼠血浆同型半胱氨酸水平的生物学作用。为rhBHMT作为治疗高同型半胱氨酸血症生物工程药物提供了科学基础。

全文目录

英文缩略词表  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-15
第一章 rhBHMT 的基因克隆、表达与纯化  15-37
  第一节 rhBHMT 的基因克隆、表达  15-27
    材料与方法  15-24
    实验结果  24-27
  第二节 rhBHMT 的纯化  27-36
    材料与方法  27-30
    实验结果  30-36
  小结  36-37
第二章 rhBHMT 生物学功能的研究  37-51
  第一节 rhBHMT 酶活性的鉴定  37-42
    实验原理与方法  37-39
    实验结果  39-42
  第二节高同型半胱氨酸血症大鼠模型的建立  42-46
    材料与方法  42-44
    实验结果  44-46
  第三节 rhBHMT 生物学功能研究  46-50
    材料与方法  46-48
    实验结果  48-50
  小结  50-51
讨论  51-55
结论  55-56
参考文献  56-63
文献综述  63-79
  参考文献  71-79
附  79-83
个人简历  83-84
致谢  84

重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶蛋白的研制

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