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MEK1/2全长结构及磷酸化激活的分子机理的计算结构生物学研究

作　者: 梁浩
导　师: 刘少君; 刘涛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: MEK1/2 磷酸化修饰分子机理计算结构生物学
分类号: R34
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

多种信号经由相同或类似信号分子传递,导致不同生物学效应,是一种广泛存在的细胞信号转导现象,有关其中共同通路部分如何对不同信号进行分拣和传递,其详细的分子构象过程和机理目前并不完全清楚。ERK/MAPK信号通路就是这样一条重要的细胞内共同通路。与胞外信号分子结合后,多种细胞表面受体都可引发MEK和ERK的依次磷酸化激活,磷酸化激活的ERK可再与上百种下游蛋白底物(如转录调控因子)相互作用,从而调节多种基因的表达并引起相应的细胞变化。研究表明,不同信号经ERK/MAPK信号通路传递后可产生不同甚至相反的细胞生物学效应。值得注意的是,MEK作为该通路中的一个关键节点分子,只包括两个蛋白分子(MEK1和MEK2),而且其蛋白序列具有很高的相似性,却可以分别传递如此众多的不同信号,势必与其细微的构象变化密切相关,但具体机理目前并不清楚。因此,研究MEK蛋白分子在各种功能状态下的三维结构动态性,将为解释此类共同通路的信号分拣传递原理提供非常好的范例。经过多年努力,目前已获得MEK分子的多个三维结构,但无一例外,它们都缺失三部分的构象信息,即N端区、PR区和C端区;分析认为这三个部分都具有相当的柔性,因此传统的结晶技术一直无法获得它们的三维结构信息。遗憾的是,这三个部分不仅是MEK1和MEK2的主要氨基酸序列差异区,更是重要的功能区。N端区不仅直接参与和ERK的相互作用,而且还参与MEK活性的下调以及MEK分子的出核;PR区中的三个磷酸化位点不仅可以上调或下调MEK的活性,而且也可以影响MEK与上下游信号分子形成复合体的能力;C端区可能与MEK的亚细胞定位以及活性调节有关。可见,这些重要部分三维结构信息的缺失,严重影响对MEK功能机理的研究,因此很有必要首先获取MEK1和MEK2的全长三维结构。目前的计算结构生物学已经可以运用同源模建和从头折叠方法分别对不同大小蛋白分子进行较为准确的三维结构构建,并对其结构特性进行分子动力学模拟研究。本工作即利用该技术的这一优势,尝试对MEK1和MEK2的完整三维结构进行构建,并模拟研究其三维结构的分子动力学特性和磷酸化激活过程,初步探究ERK/MAPK共同信号通路的信号传递机理。MEK分子三维结构信息未知的N端区,MEK1为1-38位氨基酸,MEK2为1-59位氨基酸,在PDB数据库中均没有可用的三维结构模板。因此本工作采取从头折叠的方式构建这两段三维结构。二级结构分析表明,MEK1的26-62位和MEK2的30-66位氨基酸符合螺旋的序列特征,因此,选取MEK1的1-64位氨基酸和MEK2的1-68位氨基酸分别进行多轨迹长时间的从头折叠。结果显示,MEK1可形成超过30个氨基酸的长螺旋结构,主要坐标聚类中,该螺旋能够保持结构的完整性,与二级结构分析的结果一致,因此选择其中的最低势能构象用于构建MEK1完整三维结构。MEK2也可形成长螺旋结构,但该螺旋的稳定性明显低于MEK1,如可在其C末端出现解旋、扭曲或者螺旋断裂;此外,折叠过程中还出现了一种多个间断小螺旋卷曲在一起的构象,其势能很低,但不够稳定,出现的频率很少;因此,分别取其优势坐标聚类中的最低势能构象和所有轨迹中的最低势能构象用于构建MEK2完整三维结构。本工作采用MODELLER软件对MEK1进行全长三维结构模建,首先以从头折叠的N端1-59位结构与晶体结构3EQI的45-381位结构为模板进行模建,其中,PR区和C端区结构由软件直接构建。对得到的构象进行初步分析,发现60位氨基酸之后的蛋白质主体对1-60位氨基酸的结构可能构成较大的静电排斥作用,从而存在使1-60位结构远离蛋白质主体的可能。因此,又以从头折叠的1-64位结构与晶体结构3EQI的61-381位结构为模板进行模建,其中,PR区和C端区结构同样由软件直接构建,从而得到1-60位结构远离蛋白质主体的第二种全长三维结构。对这两种全长结构进行多轨迹长时间分子动力学模拟,结果显示,第一种结构的势能明显低于第二种结构,构象也相对比较稳定,其中与ERK相互作用的1-6位氨基酸在模拟的大部分构象中都处于N端长螺旋与蛋白质主体间,且位于不利于与ERK相互作用的构象位置,只在少部分构象位于可与ERK相互作用的构象位置,这与文献报道的MEK与ERK的弱结合现象相符,而且这一构象特点可以解释文献报道的N端螺旋结构完整性会影响MEK与ERK结合能力的现象。第二种结构中,N端长螺旋会在远离蛋白质主体的空间摆动,分析显示,MEK的N端1-6位氨基酸与ERK结合后,N端区需要相当大的构象变化才能将ERK置于被MEK磷酸化的合适位置,因此,N端长螺旋的摆动很可能就是这种较大构象变化潜能的反映。此外,在这两种结构的模拟过程中,N端结构均展示出相当的柔性,这与人们一直不能成功结晶MEK1全分子的结果也是相符的。同样,分别以MEK2从头折叠的两种N端构象和晶体结构1S9I为模板,模建得到MEK2全分子的两种三维结构。对这两种全长结构进行多轨迹长时间分子动力学模拟,结果分析显示,N端取长螺旋的构象更加合理。此外,与MEK1的模拟结果相比,MEK2的N端表现出更高的柔性,这可能与它们的序列差异有关,也可能与它们N端长螺旋的初始构象位置不同相关。为充分对N端构象进行取样,还应该以MEK1的全分子结构为模板构建MEK2的第三种全分子结构并进行分子动力学模拟分析,遗憾的是,限于计算资源,这部分工作尚未完成。研究表明,MEK1的激活涉及Ser218和Ser222的磷酸化,为探讨MEK1磷酸化激活过程的构象变化特点和机理,本工作还构建了MEK1结合ATP的构象,Ser218和Ser222分别单磷酸化的MEK1构象,以及Ser218和Ser222双磷酸化并结合ATP的MEK1构象,并分别进行了分子动力学模拟分析和比较。结果显示,MEK1结合ATP后,Ser218和Ser222更加暴露,因此更易于被磷酸化。单磷酸化后即可引起N端长螺旋的构象变化,而双磷酸化则会引起更大的构象变化,从而使N端的ERK结合区充分暴露出来,处于易于结合ERK的构象位置。以往研究显示,MEK在非激活状态下就可以结合ATP,而且其正常激活需要双磷酸化。这些模拟结果不仅很好解释了这些实验现象,而且也清晰展示出了MEK1磷酸化激活过程的构象变化特点和机理,并为进一步研究激活的MEK1与ERK的相互作用过程奠定了结构基础。综上所述,本工作构建得到了合理的MEK1全长三维结构并对其分子动力学特征进行了研究;揭示了MEK1磷酸化激活过程的构象变化特点和机理;还初步构建了MEK2的全长三维结构。为深入研究ERK/MAPK共同信号通路的信号传递机理奠定了重要基础。

全文目录

缩略词表  4-6
摘要  6-9
Abstract  9-13
前言  13-18
第一部分 MEK 分子完整三维结构的构建  18-62
  第一节 MEK 分子N 端多肽的从头折叠  18-38
    1 利用 AMBER9 软件构建MEK N 端直链多肽结构  19-20
    2 M64 和M68 体系的分子动力学模拟  20-21
    3 M64 的分子动力学模拟结果分析  21-29
    4 M68 的分子动力学模拟结果分析  29-36
    5 讨论  36-38
  第二节 MEK 分子完整三维结构的构建  38-62
    1 MEK1 完整三维初始结构的构建  38-39
    2 MEK2 完整三维初始结构的构建  39-40
    3 MEK 完整三维初始结构的分子动力学模拟  40-41
    4 MEK1A 的结果分析与讨论  41-47
    5 MEK18 模拟结果与讨论  47-52
    6 MEK2A 的结果分析与讨论  52-57
    7 MEK28 的结果分析与讨论  57-62
第二部分 MEK1 磷酸化激活机制探讨  62-88
  第一节单磷酸化MEK1 的分子动力学模拟  62-72
    1 MEK1 单磷酸化修饰模拟体系的建立和分子动力学模拟  62-64
    2 结果分析  64-71
    3 讨论  71-72
  第二节 MEK1-ATP 复合物的分子动力学模拟  72-79
    1 MEK1-ATP 复合物模拟体系的建立和分子动力学模拟  72-73
    2 结果分析  73-78
    3 讨论  78-79
  第三节双磷酸化MEK1-ATP 复合物的分子动力学模拟  79-88
    1 ppMEK1-ATP 复合物模拟体系的建立和分子动力学模拟  79-80
    2 结果分析  80-85
    3 讨论  85-88
结论  88-89
参考文献  89-92
附录  92-94
综述  94-99
  参考文献  96-99
个人简介  99-100
致谢  100-101
发表文章  101-113

MEK1/2全长结构及磷酸化激活的分子机理的计算结构生物学研究

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