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受钙影响花生（Arachis hypogaea L.）胚胎败育的分子机理研究

作　者: 张君诚
导　师: 庄伟建
学　校: 福建农林大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 胚败育钙调节分子机理花生
分类号: S565.2
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

胚胎早期发育是花生产量和品质形成的重要时期，其幼胚发育的正常与否直接关系到以种子为经济指标的花生生产的效益。缺钙花生严重空荚或不饱满而导致减产降质的生产问题长期困扰南方沙质土壤地区花生生产。本研究以高低钙条件下大田和水培花生的种植与观察为基础，成功开展了花生胚胎败育与可育的基因差异显示、差异蛋白质组学方面的研究，初步揭示受钙影响花生胚胎败育的分子机理，主要研究结果如下： 1．开展受钙影响水培和大田（福建平潭）花生植株与幼胚生长发育特性观察与比较，总结空荚发生模式与特征，田间试验表明：大田低钙环境对花生地上部植株的生长发育影响较小，而对荚果发育影响较大，低钙植株烂果或空荚和营养体徒长与返青现象显著；水培实验进一步证实20mg·L^-1Ca²⁺浓度是花生败育的临界浓度。低钙使花生植株矮小，烂果和空荚增多，但不出现营养体徒长。比较认为大田花生更适合作为基因差异显示和差异蛋白质组学等研究的实验材料。提出砂质旱地增施钙肥（石膏、壳灰）以防治花生空荚的方案和注意事项，为指导生产实践提供参考。 2．开展受钙影响花生幼胚基因差异显示研究，摸索出花生幼胚高质量总RNA的提取方法；首次建立和优化了花生幼胚mRNA荧光差异显示实验的技术体系：利用该体系成功筛选得到L^#、1^#、3^#、8^#等四个花生早期胚胎（9d）败育／正常发育的基因差异表达片段，经反向Northern Dot blot和RT-PCR证实为阳性差异片段。测序和检索分析认为L^#差异片段与拟南芥（Arabidopsis thaliana（thale cress））和水稻等的ATP依赖-Clp蛋白酶的ATP捆绑亚单位同源性较高，该基因在低钙组的上调表达提示低钙组幼胚细胞内能量转化和物质的转运受到胁迫。已在Genebank登记该片段（基因号为AY517932）。8^#差异片段与陆地棉（Gossypium hirsutum）MADS box基因mRNA同源性较高，初步分析认为这可能与低钙组幼胚发育调节紊乱相关，该片段已在Genebank登记（基因号为AY517932）。3^#和1#差异片段未能在数据库中检索到较匹配的序列，也可能是个未报道的基因片段。在此基础上，克隆得到了花生MADS box基因的包含编码区和3’-UTR在内的cDNA序列，长度为785bp，编码261个氨基酸，与已报道多种植物的MADS box的基因和氨基酸序列同源性分别在83%和90%以上，这在花生上国内外尚未有见报道。 3.开展了受钙影响导致花生早期胚胎败育的差异蛋白质组学研究。建立适合花生蛋白质的双向电泳技术体系，结合MALD工一TOF质谱和相关蛋白质数据库等蛋白质组学研究手段首次筛选了花生早期胚胎败青/发育的7个差异表达蛋白。初步检索发现:4.差异蛋白点是与叶绿体被膜休克相关蛋白（来源于SPl’nacia。lerace“L.）高度相似的低钙组表达上调的特异蛋白，这提示低钙胚内膜系统出现生理和或运转障碍。6招差异蛋白与线粒体前体中的ATP合成酶的刀链高度相似，该蛋白在低钙幼胚缺失提示花生幼胚受钙胁迫时ATP合成酶的合成和组装严重受阻。7‘差异蛋白可能与茄属植物（Sola刀姗tuberos二）的肌动蛋白97或100同源，该蛋白在低钙组缺失说明败育胚此时（入土9天）的细胞骨架系统发育或细胞分裂等重要生理活动可能受阻。2，、3.差异蛋白分别与3一磷酸甘油醛脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶具一定同源性，这两种蛋白在低钙组幼胚的未表达提示低钙幼胚的氧化还原反应系统可能不正常。而1‘和5件蛋白点得分较低，有可能是未知蛋白。由以上研究结果初步可以认为:受钙胁迫花生幼胚败育的分子机理可能是与早期幼胚内与能量转化（ATP的合成）、氧化还原系统运转、细胞内膜以及细胞骨架功能维持相关的功能基因的转录和表达异常有关。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
常用英文缩略语  9-10
前言  10-12
第一章文献综述  12-36
  1 钙和Ca~(2+)-CaM信号系统调控植物生长发育的研究进展  12-18
    1.1 调控植物生长发育的研究进展  12-16
    1.2 植物Ca~(2+)-CaM信号系统及其信号传导研究进展  16-18
    1.3 钙素缺乏花生的生理病理反应  18
  2 植物基因分离克隆方法及mRNA差异显示的研究进展  18-28
    2.1 植物基因分离与克隆方法研究现状  18-21
    2.2 mRNA差异显示技术及其应用研究现状  21-28
  3 蛋白质组学研究原理与文献综述  28-34
    3.1 蛋白质组研究的开端及“蛋白质组”含义  29-30
    3.2 蛋白质细研究的技术路线与相关技术  30-33
    3.3 生物信息学与蛋白质组数据库  33-34
    3.4 差异蛋白质组学的提出与研究  34
  4 问题的提出与研究意义  34-36
第二章受钙影响花生空秕的表现与防治措施研究  36-50
  材料与方法  36-38
  结果与分析  38-42
    1 不同钙处理下平潭大田花生相关性状考察  38-41
    2 不同水平钙处理对水培花生生长发育的影响  41-42
  讨论  42-50
第三章受钙影响花生胚败育分子机理的基因差异显示研究  50-75
  材料与方法  50-57
    1 实验材料  50-51
    2 实验方法  51-57
  结果与分析  57-70
    1 花生幼胚材料的选择和剥取  57-58
    2 花生幼胚总RNA提取结果与分析  58-60
    3 受钙影响花生胚败育的基因差异表达片段的筛选与鉴定的结果和分析  60-70
      3.1 逆转录与DDPCR技术的优化  60-62
      3.2 差异表达基因的DDRT分离结果  62-64
      3.3 差异片段(荧光差示获得)重扩增和反向Northern Dot Blot初步验证  64-65
      3.4 阳性差异条带的克隆与序列分析  65-67
      3.5 差异片段RT-PCR验证结果与分析  67-70
  讨论  70-75
    1 关于幼胚材料的安全剥取的探讨  70
    2 花生幼胚总RNA的提取方法优化  70-71
    3 植物胚胎发育与重要基因的特异表达有关  71-72
    4 差异显示技术路线的确定、优化与技术利弊  72-73
    5 差异显示技术重复性与假阳性的问题  73-74
    6 高浓度琼脂糖电泳展示DDRT-PCR结果的方法探讨  74-75
第四章受钙影响花生胚胎差异表达蛋白质的分离与鉴定  75-92
  材料与方法  75-80
    1 花生材料与处理  75
    2 实验主要试剂与仪器  75-76
    3 花生幼胚蛋白的提取与含量测定  76-77
    4 蛋白质双向电泳  77-79
    5 差异蛋白点的质谱分析  79-80
  结果与分析  80-87
    1 二种蛋白质提取方法的结果比较  80-81
    2 高低钙条件下不同发育时期花生幼胚蛋白含量比较  81
    3 钙诱导花生幼胚差异表达蛋白质的分离  81-83
    4 差异蛋白的肽指纹图谱的获得  83-86
    5 差异蛋白的肽指纹图谱数据库分析  86-87
  讨论  87-92
    1 花生幼胚蛋白质双向电泳的样品制备  87-88
    2 花生幼胚蛋白质双向泳实验体系的建立与优化  88-89
    3 关于植物胚胎发育的特异蛋白的研究  89-90
    4 关于蛋白点胶内酶解的操作  90
    5 关于肽指纹图谱技术与蛋白数据库检索  90-92
第五章花生MADSbox基因cDNA的克隆和初步鉴定  92-102
  材料与方法  92-94
  结果与分析  94-100
  讨论  100-102
结论与展望  102-104
参考文献  104-115
附录Ⅰ 本实验所用引物与载体  115-118
附录Ⅱ 在读期间发表论文与参研课题  118-120
致谢  120

受钙影响花生（Arachis hypogaea L.）胚胎败育的分子机理研究

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