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红光熊蜂Sigma型谷胱甘肽硫转移酶的基因克隆与诱导表达

作　者: 惠伟丽
导　师: 陈珊
学　校: 东北师范大学
专　业: 微生物
关键词: 红光熊蜂谷胱甘肽硫转移酶氧化胁迫杆状病毒表达系统
分类号: Q963
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

红光熊蜂（Bombus ignitus）是许多农作物尤其是温室作物重要的传粉昆虫。由于熊蜂具有进化程度低、趋光性差、耐低温,且适应温室环境能力强等优势,在温室果菜传粉中得到了广泛应用。熊蜂功能基因组学的研究为全面、准确了解熊蜂生物性状的遗传基础和分子调控机制提供了理论和技术支持。谷胱甘肽硫转移酶是一类多功能酶系,主要在解毒代谢和保护氧化损伤方面有重要作用。大多数关于昆虫GSTs的研究主要关注它们清除外源性化合物,尤其是杀虫剂的功能,本论文主要着重研究受外源氧化胁迫时的GSTs的诱导表达。本篇论文首先通过实验和生物信息学相结合的方法克隆并鉴定出红光熊蜂的一类sigma家族的GST基因（BiGSTS）。结果分析表明BiGSTS全长1490bp,包括4个外显子和3个内含子,开放阅读框（ORF）长603 bp,能编码201个氨基酸序列,具有一个保守的酪氨酸催化残基和保守的GSH结合位点;序列比较分析表明预测的BiGSTS的氨基酸序列和膜翅目昆虫的sigma家族GSTs的氨基酸序列具有高度同源性,比如和意大利蜜蜂（Apis mellifera）具有70%蛋白序列相似性,和红火蚁Solenopsis invicta具有59%的蛋白序列相似性;并将测序得到的BiGSTS的基因序列提交NCBI库（GenBank no: HM101135）。系统发育分析表明BiGSTS与昆虫GSTs的Sigma型相似关系最近。其次是对BiGSTS的组织分布分析:利用工蜂cDNA文库通过表达序列标签（ESTs）筛选出的含有目标cDNA片段的质粒pBluescript-BiGSTS通过亚克隆,与昆虫病毒转移载体形成重组体,重组BiGSTS蛋白在以杆状病毒感染的昆虫细胞Sf9中得以表达后,SDS-PAGE分析得出其分子量大约在28KD;利用western blot检测BiGSTS蛋白在工蜂各组织的分布情况,结果表明BiGSTS分布在多种组织中,包括脂肪体、中肠、肌肉以及表皮。最后对红光熊蜂在受氧化胁迫时GSTs的表达模式进行了研究分析:通过qRT-PCR方法得到的分析结果表明,注射过量的H₂O₂之后,基因BiGSTS和BiGSTD在各组织转录水平的表达量有明显的上调;而且在注射9小时后诱导表达量达到最高峰。研究表明红光熊蜂的这两种GSTs都是可受氧化胁迫诱导的抗氧化酶类。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章引言  9-23
  1.1 GST 的研究进展  9-17
    1.1.1 GST 的分类  9-10
    1.1.2 GST 的命名  10
    1.1.3 GST 的进化  10-11
    1.1.4 GST 的结构  11-14
    1.1.5 GST 的主要功能  14-15
    1.1.6 谷胱甘肽硫转移酶的诱导表达  15-16
    1.1.7 谷胱甘肽硫转移酶的表达调控机制  16-17
  1.2 相关实验技术介绍  17-20
    1.2.1 蓝白斑筛选原理  17
    1.2.2 杆状病毒表达系统  17-19
    1.2.3 实时定量PCR(qRT-PCR)  19-20
  1.3 本研究的目的与意义  20-21
    1.3.1 研究目的  20-21
    1.3.2 研究意义  21
  1.4 主要研究内容与技术路线  21-23
    1.4.1 研究内容  21-22
    1.4.2 技术路线  22-23
第二章红光熊蜂BiGSTS 基因的获得与生物信息学分析  23-32
  2.1 材料  23
    2.1.1 材料与数据源  23
    2.1.2 分析工具与软件  23
    2.1.3 相关试剂  23
  2.2 方法  23-25
    2.2.1 对cDNA 文库进行蓝白斑筛选  23-24
    2.2.2 DNA 测序及序列分析  24-25
    2.2.3 GST 基因组DNA 的克隆  25
  2.3 结果与分析  25-31
    2.3.1 红光熊蜂GST 基因（BiGSTS）的鉴定、分类  25-27
    2.3.2 红光熊蜂GST 基因组DNA 的克隆与结构分析  27-31
  2.4 讨论与结论  31-32
第三章红光熊蜂BiGSTs 基因的真核表达与抗体制备  32-38
  3.1 材料和试剂  32
    3.1.1 质粒、菌株、细胞系以及实验动物  32
    3.1.2 酶和试剂  32
  3.2 方法  32-35
    3.2.1 重组昆虫病毒转移载体的构建与鉴定  32-33
    3.2.2 在昆虫细胞中以杆状病毒为载体表达目的基因  33-34
    3.2.3 多克隆抗体的制备  34
    3.2.4 Western blot 分析  34-35
  3.3 结果与分析  35-37
    3.3.1 重组转移载体质粒的构建与鉴定  35-36
    3.3.2 重组转移载体质粒转染sf9 细胞  36
    3.3.3 鉴定重组蛋白的表达  36-37
  3.4 讨论与结论  37-38
第四章红光熊蜂BiGSTs 基因的组织表达分析和应激反应中的表达模式  38-44
  4.1 材料与方法  38
    4.1.1 材料  38
    4.1.2 设备与试剂  38
  4.2 方法  38-39
    4.2.1 从组织中提取蛋白  38
    4.2.2 H_2O_2 诱导实验  38
    4.2.3 提取RNA  38-39
    4.2.4 实时定量PCR(qRT-PCR)  39
  4.3 结果与分析  39-42
    4.3.1 转录和翻译水平分析组织中BiGSTS 的分布  39-41
    4.3.2 H_2O_2 处理后BiGSTS 基因和BiGSTD 基因在不同组织中的诱导表达  41-42
  4.4 讨论与结论  42-44
    4.4.1 BiGSTS 的组织分布  42-43
    4.4.2 不同组织中gst 基因在应对氧化胁迫时的表达模式  43-44
第五章总结与展望  44-45
参考文献  45-52
在学期间公开发表论文  52-53
附录  53-54
致谢  54

红光熊蜂Sigma型谷胱甘肽硫转移酶的基因克隆与诱导表达

内容摘要

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