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芥子气血浆暴露标志物定量分析方法及其毒物代谢动力学的研究

作　者: 李春正
导　师: 李桦; 谢剑炜
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 芥子气血浆生物标志物代谢产物毒物代谢动力学液相色谱-串联质谱定量分析
分类号: R114
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

芥子气（Sulfur Mustard, SM）是强效的糜烂性毒剂，是日本在我国遗留化学武器的主要填充剂，它具有合成简便、作用持久、防护困难等特点，是一类难防难治的化学战剂。芥子气进入生物体后迅速分布于各组织中，主要存在形式为毒剂原型、水解氧化产物、β-裂解产物和大分子加合物等。这些游离或结合的具有芥子气结构特征的化合物，统称为芥子气的生物标志物。按照其来源和体内停留时间，芥子气生物标志物可分为两类：小分子代谢产物和生物大分子的加合物。代谢产物标志物包括芥子气的水解和氧化产物、以及与谷胱甘肽加合后的β-裂解产物；这些小分子标志物在芥子气暴露后很快出现在体液中，取决于染毒途径和剂量，它们在机体内的停留时间为数日至两周；这些代谢产物标志物可以作为芥子气的早期暴露标志物，在接触或染毒的早期用于中毒鉴别和诊断。本研究以芥子气的代谢产物标志物为研究对象，应用现代仪器分析、分析毒理学、定量毒理学和毒物代谢动力学的理论和技术，通过标准品合成、定量检测关键技术的建立、标志物血浆动力学的研究和分析，以及技术方法和研究成果的应用研究，为芥子气的医学防护提供毒剂标志物体内处置过程的新认识，为芥子气的中毒诊断和防治措施研究提供新颖可行的定量检测技术。本研究以芥子气为起始原料，通过优化和控制反应条件，成功合成了9个芥子气代谢产物标准对照品和1个内标标准品，应用NMR、IR、MS等技术对它们的结构进行了确证，获得的标准品纯度均>95%。在此基础上，首次建立了芥子气血浆标志物定量检测关键技术，应用LC-MS/MS技术同时检测大鼠血浆中7个芥子气的代谢产物标志物（TDG、TDGO，SMO、SBMTE、MSMTESE、SBMSE和SBSNAE），并对方法学进行了全面的验证。结果表明，本方法的专属性好、灵敏度高，回收率、精密度和准确度均符合生物样品定量分析要求。与已报道的方法相比，本方法的灵敏度与其相当或更高，并具有线性范围宽、样品需用量少、采用一步沉淀蛋白法处理样品、简便快捷、可用于大量样品的快速分析等优点，为芥子气染毒血浆样品的检测提供一个综合解决方案。应用建立的定量检测技术，系统研究了代谢产物标志物在芥子气染毒大鼠的血浆动力学。大鼠皮下和皮肤染毒3个剂量芥子气后，在0.08-72h的时间段内可在血浆中检出芥子气的7个代谢产物(SMO、TDG、TDGO、SBMTE、SBMSE、MSMTESE和SBSNAE)。研究还发现，SMO是芥子气染毒后血循环中的主要产物，也是良好的暴露标志物。动力学分析结果表明，SMO、TDGO、SBMSE、MSMTESE和SBSNAE的血浆暴露与剂量之间有明确并良好的线性相关性，血浆浓度随剂量增大呈线性增高，定量时间窗为染毒后5min至48h的不同时间段，因此，这些代谢产物可以用作芥子气中毒血浆暴露和诊断标志物。比格犬皮下染毒芥子气后的毒物代谢动力学研究表明，芥子气血浆代谢产物的生成及动力学在比格犬和大鼠之间存在种属差异，主要表现为比格犬体内较弱的谷胱甘肽加合-β裂解反应以及SBSNAE生成的缺失。比格犬染毒芥子气后，SMO、TDG和TDGO是更适宜的血浆暴露和诊断标志物。将建立的芥子气标志物定量检测关键技术应用于芥子气皮肤防护膏和洗消剂的效能评价中，以标志物的血浆暴露水平为指标，确证了自行研制的皮肤防护膏和洗消剂能有效地防护芥子气中毒损伤。染毒前正确使用皮肤防护膏，可防止约96%的芥子气通过皮肤吸收；在芥子气染毒后及时（6min）用洗消剂消毒，至少能减少80%的体内毒剂暴露量。此外，应用研究的结果也证明标志物定量检测技术在芥子气防护措施评价中的可行性，为芥子气防治研究提供了快速、准确的定量评价手段。将标志物定量检测技术用于意外化学品中毒伤员生物样品的检测，通过血浆、组织渗出液和尿样的定量检测，确证4位伤员是因接触芥子气中毒，并为伤员的暴露时间及中毒程度判断提供重要的定量化数据。这一应用实例展示了早期暴露标志物及其定量检测技术在芥子气暴露确证和中毒诊断中的良好应用前景。本论文有如下的创新点或新发现：1)首次建立了芥子气血浆标志物的定量检测关键技术，该技术可同时检测血浆样品中芥子气的7个代谢产物，技术指标与已报道方法相当或达到更高水平；本研究将SMO作为芥子气暴露标志物纳入定量检测方法，以及将LC-MS/MS技术用于生物样品中TDG和TDGO的直接定量分析也未见报道。2)通过芥子气血浆标志物毒物代谢动力学的系统研究和标志物血浆暴露水平-时间动力学过程的分析，揭示了毒剂染毒剂量与标志物血浆暴露水平之间的相关性，提出了适用于暴露确证和中毒诊断的血浆标志物种类及其检测时间窗，为将血浆标志物检测用于中毒诊断提供了必要的科学依据。3)本研究发现SMO是芥子气染毒后血循环中的主要产物，也是良好的暴露标志物；比格犬染毒芥子气后体内谷胱甘肽加合-裂解的转化途径显著弱于大鼠，犬体内因缺乏N-乙酰转移酶而导致SBSNAE生成的缺失。4)本研究首次将血浆暴露标志物的定量检测技术应用于芥子气防护措施的评价，为芥子气中毒的医学防治研究提供了可靠、准确和快速的定量化评价手段。

全文目录

英文缩略词表  5-7
实验材料  7-9
摘要  9-12
Abstract  12-16
第一章前言  16-25
  第一节芥子气中毒及防治  16-17
  第二节芥子气生物标志物及其研究进展  17-21
  第三节芥子气血浆暴露标志物及其研究意义  21-25
第二章芥子气代谢产物对照品及内标化合物的合成  25-33
  第一节芥子气代谢产物的合成  25-29
  第二节芥子气代谢产物的鉴定与表征  29-32
  本章小结  32-33
第三章芥子气血浆暴露标志物定量分析方法研究  33-51
  第一节定量检测方法学的建立  33-37
  第二节定量检测方法学的验证  37-49
  本章小结  49-51
第四章芥子气血浆暴露标志物的毒物代谢动力学研究  51-81
  第一节大鼠皮下染毒的芥子气标志物血浆动力学  52-61
  第二节大鼠皮肤染毒的芥子气标志物血浆动力学  61-73
  第三节比格犬皮下染毒的芥子气标志物血浆动力学  73-79
  本章小结  79-81
第五章芥子气血浆标志物检测关键技术的应用研究  81-93
  第一节芥子气防护膏和洗消剂的防护效能评价  81-87
  第二节芥子气意外中毒伤员的暴露确证  87-92
  本章小结  92-93
结论  93-95
参考文献  95-99
附录一文献综述  99-113
  参考文献  108-113
附录二个人简历  113-115
附录三博士在读期间发表相关文章  115
博士在读期间参加学术会议  115-117
附件  117-123
致谢  123-124

芥子气血浆暴露标志物定量分析方法及其毒物代谢动力学的研究

内容摘要

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