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HILIC-MS/MS快速测定血浆中游离氨基酸方法的建立及其在药代动力学研究中的应用

作　者: 杨志晖
导　师: 宋海峰
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: HILIC-MS/MS 血浆氨基酸定量分析药代动力学
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

氨基酸是蛋白质的基本单元,是人体完成生理功能的必须物质。体内氨基酸水平处于内源性蛋白质的释放与各组织利用之间的动态平衡之中。当这种动态平衡被打破时,就会出现血液氨基酸浓度的改变,导致氨基酸代谢紊乱和相关疾病的发生。另外,氨基酸制剂在临床上广泛应用于相关疾病的治疗和营养支持剂。因此监测体内氨基酸水平的变化规律,对疾病的诊断和治疗有重要意义。发展普适性广、检测速度快、灵敏高、分离度好、重复性优良的体内氨基酸分析方法,一直是氨基酸分析领域探索的重要课题。本研究的目的就是建立快速检测血浆中游离氨基酸的亲水作用色谱-串联质谱（HILIC-MS/MS）法,并将该方法应用于氨基酸类药物的非临床药代动力学研究,初步评价氨基酸类药物α-酮戊二酸鸟氨酸盐（α-KGO）给药后鸟氨酸（Orn）在小鼠体内的药代动力学特征。本论文第一部分选择了五种氨基酸为代表性氨基酸,包括谷氨酸（Glu,酸性氨基酸）,缬氨酸（Val,中性氨基酸、支链氨基酸）,鸟氨酸（Orn,碱性氨基酸、直链氨基酸、非蛋白氨基酸）,苯丙氨酸（Phe,芳香族氨基酸、中性氨基酸）和组氨酸（His,杂环氨基酸、碱性氨基酸）。系统考察了流动相中不同有机相、有机相比例、缓冲液pH、缓冲液浓度及流速对不同结构氨基酸分析的影响。结果表明,酸性和中性氨基酸保留时间短,响应值高,峰形好,分析时受色谱条件影响较小;碱性氨基酸保留时间长,响应值相对较低,峰较宽,分析时需降低缓冲液pH,提高水相比例,提高缓冲液浓度,提高流速,以缩短保留时间,改善峰形。另外,调整流动相洗脱梯度,HILIC柱可以分离同重氨基酸。通过上述条件优化,建立了同时快速测定水溶液中酸性（Glu）、中性（Val、Phe）和碱性（His,Orn）氨基酸的HILIC-MS/MS法,单个样品运行时间仅为10 min。考察了各项方法学指标,结果表明,各氨基酸浓度在0.1⁵0μmol·L^-1范围内线性关系良好,最低定量限为0.1μmol·L^-1,最低检测限（S/N > 3）在0.01⁰.05μmol·L^-1,日内和日间精密度均在0.7 %¹0.3 %之间,准确度均在89.1 %¹07.6 %之间,加样回收率在91.7 %¹04.5 %范围内,氨基酸混合标准溶液在室温放置8 h、样品盘放置12 h、反复冻融三次、-80℃冷冻保存1月条件下均保持稳定。在建立生物基质中氨基酸定量分析方法时,由于存在内源性氨基酸干扰,本研究采用空白扣除法建立标准曲线。在空白生物基质中外加氨基酸标准品配制系列模拟生物样品,建立定量标准曲线时统一扣除生物基质中内源性氨基酸响应值,用增加的响应值与外加氨基酸浓度作线性回归分析。建立了同时快速检测大鼠血浆中酸性（Glu）、中性（Val、Phe）和碱性（His,Orn）氨基酸的HLILC-MS/MS方法。血浆样品前处理采用简单的乙腈蛋白沉淀法,单个样品运行时间仅为10 min。方法学考察结果表明,此方法特异性好,外加各氨基酸浓度在25⁸00μmol·L^-1内范围内线性关系良好,最低定量限为25μmol·L^-1,日内和日间精密度均在1.5 %¹1.3 %之间,准确度均在98.7 %¹10.1 %之间,加样回收率在88.7 %¹05.1 %范围内,血浆样品在室温放置8 h、样品盘放置12 h和反复冻融三次条件下,Glu、Val和Phe有轻微降解,His和Orn保持稳定。本论文的第二部分,以氨基酸类抗辐射药物α-KGO为研究对象,将上述HILIC-MS/MS分析方法应用于α-KGO在小鼠体内的药代动力学研究中。建立了快速测定小鼠血浆中Orn的HILIC-MS/MS法,单个样品运行时间10 min,质谱检测时间8 min,用空白扣除法建立小鼠血浆基质中Orn定量标准曲线。方法学确证结果表明,特异性良好,小鼠血浆中Orn浓度在25⁴000μmol·L^-1范围内线性关系良好,最低定量下限为25μmol·L^-1,日内和日间精密度均在1.3 %⁶.9 %之间,准确度在100.4 %¹02.4 %之间,小鼠血浆中Orn加样回收率在97.3 %¹04.5 %范围内,小鼠血浆室温放置8 h、反复冻融三次、样品盘放置12 h和-80℃冷冻保存2周条件下,Orn能保持稳定,各项指标均满足药代动力学研究的方法学要求。小鼠口服不同剂量α-KGO后Orn的初步药代动力学研究结果表明,Orn在小鼠体内吸收迅速,低剂量组30 min达峰,峰浓度为479±89.8μmol·L^-1,高剂量组45 min达峰,峰浓度为2488.5±304.1μmol·L^-1,低、高剂量组相比有统计意义差别;药-时曲线下面积随给药剂量增加而增加;末端消除相半衰期t_1/2为5 min左右,低、高剂量组血浆清除率CL/F分别为85.57,38.99 mL/min/kg。静脉注射给药后即刻血药浓度达峰,随后迅速分布、消除,血浆清除率CL/F为46.82 mL/min/kg,末端消除相半衰期t_1/2为8.58 min,峰浓度为1328.5±63.6μmol·L^-1,与同剂量口服给药组相比有统计意义差别。按口服给药的AUC_0-t与等当量静脉给药的AUC_0-t比值计算口服给药的绝对生物利用度,小鼠口服α-KGO后Orn生物利用度为54.7%,生物利用度较高。

全文目录

中英文缩略词表  5-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-16
第一部分 HILIC-MS/MS 快速测定血浆中游离氨基酸方法的建立  16-58
  1 实验材料和方法  16-18
    1.1 试剂  16
    1.2 仪器  16
    1.3 溶液的配制  16-17
    1.4 血浆样品前处理  17
    1.5 质谱检测条件  17-18
    1.6 色谱分析条件  18
  2 结果和讨论  18-56
    2.1 典型氨基酸的选择  18
    2.2 质谱检测条件的优化  18-22
    2.3 色谱分析条件的优化  22-31
    2.4 血浆样品预处理方法的选择  31-32
    2.5 内标物的选择  32
    2.6 水溶液中氨基酸测定方法学确证  32-43
    2.7 大鼠血浆中游离氨基酸测定方法学确证  43-56
  3 小结  56-58
第二部分 HILIC-MS/MS快速测定血浆中游离氨基酸方法在α-KGO非临床药代动力学研究中的应用  58-76
  1 实验材料和方法  58-59
    1.1 药品和试剂  58
    1.2 实验动物  58
    1.3 实验方法  58-59
  2 血浆样品的测定  59-69
    2.1 溶液的配制  59
    2.3 质谱检测条件  59-60
    2.4 色谱分析条件  60
    2.5 小鼠血浆中鸟氨酸测定方法学确证  60-68
    2.6 样品测定结果  68-69
  3 药代动力学参数估算和统计分析  69
  4 实验结果  69-75
    4.1 空白小鼠血浆鸟氨酸浓度  69
    4.2 小鼠给药后血浆鸟氨酸浓度-时间变化  69-71
    4.3 小鼠给药后血浆外源性鸟氨酸浓度-时间变化  71-73
    4.4 小鼠给药后Orn 药代动力学参数  73-75
    4.5 小鼠单次口服α-KGO 后Orn 的生物利用度  75
  5 讨论  75-76
结论  76-78
参考文献  78-80
体内氨基酸分析进展  80-88
  参考文献  85-88
反相高效液相色谱结合柱前衍生化法测定人血清中L-门冬酰胺  88-97
个人简历  97-98
致谢  98

HILIC-MS/MS快速测定血浆中游离氨基酸方法的建立及其在药代动力学研究中的应用

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