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鳕鱼皮中流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽的研究

作　者: 苑宁
导　师: 曾名湧
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工及贮藏工程
关键词: 鳕鱼皮抗流感病毒活性肽神经氨酸酶分离纯化细胞病变实验
分类号: TS254.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

神经氨酸酶（NA）是流感病毒表面重要的糖蛋白，在病毒的复制和传播过程中起重要作用。流感病毒容易产生变异，而NA活性位点高度保守，因此以NA为靶点的抗流感病毒药物成为了当前研究的热点。目前上市的NA抑制剂有扎那米韦和奥司他韦，而化学合成的药物成本高，价格贵，容易产生神经系统的不良反应以及其他的副反应，因此寻找天然抗病毒药物尤为重要。本实验以低值鳕鱼皮胶原蛋白为原料，探讨了其酶解液中活性肽的NA抑制活性，优化了酶解条件，经过分离纯化得到了高活性组分，鉴定了其结构，研究了其性质，并在细胞水平探讨了其抗病毒的作用方式。本文主要研究内容如下：1.采用不同的蛋白酶对鳕鱼皮胶原蛋白进行酶解，得到了具有流感病毒神经氨酸酶抑制活性的酶解物，在9种蛋白酶中筛选出胃蛋白酶为最佳水解用酶，其水解物的IC50值为8.86mg/mL。单因素实验分别考察了加酶量、底物浓度、酶解时间对酶解反应产物抑制活性的影响。利用响应面法优化了酶解条件，得到了利用鳕鱼皮胶原蛋白制备NA抑制活性肽的最佳条件为：加酶量1600U/g，底物浓度22mg/mL，酶解时间6.8h，优化条件后的酶解液IC50值为7.95mg/mL（P <0.05）。用10mg/mL的粗酶解液进行细胞实验，得到的抑制率为66.6%，通过细胞病变抑制实验初步验证了酶解液的抗病毒活性。2.利用超滤、Sephadex G-15凝胶柱层析、反相高效液相色谱等技术对NA抑制粗酶液进行了分离纯化，获得了一条具有NA抑制活性的多肽，鉴定其结构，并对其性质进行了研究。得到的氨基酸序列为PGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGL。采用体外模拟胃肠道消化法，测定了不同阶段消化液对NA抑制活性的影响。研究发现活性肽不能抵制消化酶的作用，经过胃肠蛋白酶水解后，NA抑制活性显著降低，甚至失活，说明该活性肽不适合经口服用，需要考虑其他的途径摄入。抑制动力学实验显示，该活性肽为竞争性抑制剂，抑制常数Ki为0.29mmol/L。3.在细胞水平上对鳕鱼皮胶原蛋白多肽的抗流感病毒活性进行了研究。用MTT法测得NA抑制活性肽的最大无毒浓度为250μg/mL。在被感染的MDCK细胞上，活性肽对流感病毒有一定的抑制活性，一定浓度范围内，抗病毒效果与活性肽浓度成正相关，其半数抑制浓度IC50为471μg/mL。以三个不同作用方式（预处理，吸附同时，吸附后）对病毒进行处理，均有明显的抗病毒效果，说明活性肽不仅能降低病毒的毒力，而且能影响病毒与宿主细胞的吸附及其进入细胞后的复制和传播，说明鳕鱼皮多肽通过多种方式抗病毒。但是不同方式的抗病毒效果不同（P<0.05），预处理组（138.7μg/mL）>吸附时处理组（319.3μg/mL）>吸附后处理组（417μg/mL），说明活性肽可能直接作用于病毒颗粒。在红细胞凝集实验中，随着活性肽的浓度增大，病毒的凝集价显著降低，说明NA抑制活性肽能显著影响HA的活性，也进一步证明了活性肽的抗病毒作用具有多靶点。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第1章前言  13-34
  1.1 鳕鱼简介  13-18
    1.1.1 鳕鱼的开发利用  13-14
    1.1.2 鳕鱼下脚料的开发利用  14-15
    1.1.3 鳕鱼皮胶原肽的研究现状  15-18
  1.2 流感病毒  18-22
    1.2.1 流感病毒简介  18-19
    1.2.2 抗流感病毒药物研究进展  19-22
  1.3 神经氨酸酶抑制剂的研究进展  22-25
    1.3.1 神经氨酸酶的生物学功能  22
    1.3.2 神经氨酸酶的结构特点  22-23
    1.3.3 神经氨酸酶抑制剂的研究现状  23-25
  1.4 本项目的立题背景、意义和主要内容  25-27
    1.4.1 本课题的立题背景和意义  25-26
    1.4.2 研究主要内容  26-27
  参考文献  27-34
第2章鳕鱼皮中 NA 抑制活性肽的制备  34-52
  引言  34-35
  2.1 材料与仪器  35-36
    2.1.1 实验材料  35
    2.1.2 实验试剂  35
    2.1.3 主要仪器  35-36
  2.2 实验方法  36-39
    2.2.1 鳕鱼皮中胶原蛋白的制备  36
    2.2.2 鳕鱼皮中 NA 抑制活性粗酶液的制备  36
    2.2.3 蛋白酶的筛选  36-37
    2.2.4 酶解单因素实验  37
    2.2.5 响应面法优化酶解条件  37
    2.2.6 蛋白质浓度的测定  37-38
    2.2.7 NA 抑制活性的测定  38-39
    2.2.8 细胞实验  39
    2.2.9 统计学分析  39
  2.3 结果与讨论  39-49
    2.3.1 蛋白酶的筛选  39-41
    2.3.2 酶解单因素实验  41-43
    2.3.3 响应面优化实验  43-48
    2.3.4 细胞实验  48-49
  2.4 结论  49
  2.5 本章小结  49-50
  参考文献  50-52
第3章 NA 抑制活性肽的分离纯化及性质研究  52-66
  引言  52-53
  3.1 材料与仪器  53-54
    3.1.1 实验原料  53
    3.1.2 主要试剂  53-54
  3.2 实验方法  54-56
    3.2.1 鳕鱼皮胶原蛋白的提取  54
    3.2.2 鳕鱼皮中 NA 抑制粗酶液的制备  54
    3.2.3 蛋白质浓度的测定  54
    3.2.4 NA 抑制活性的测定  54
    3.2.5 凝胶色谱分离  54-55
    3.2.6 反相高效液相色谱 C18半制备柱分离纯化  55
    3.2.7 反相高效液相色谱 C18分析柱鉴定纯度  55
    3.2.8 NA 抑制活性肽的结构鉴定  55
    3.2.9 NA 抑制活性肽的合成  55
    3.2.10 模拟消化实验  55-56
    3.2.11 抑制动力学实验  56
    3.2.12 统计学分析  56
  3.3 结果与分析  56-63
    3.3.1 凝胶色谱分离  56-57
    3.3.2 用反相高效液相色谱 C18半制备柱分离纯化  57
    3.3.3 用反相高效液相色谱 C18 分析柱鉴定纯度  57-58
    3.3.4 NA 抑制活性肽的结构鉴定  58-59
    3.3.5 NA 抑制活性肽的合成  59
    3.3.6 模拟消化实验结果  59-60
    3.3.7 抑制动力学实验结果  60-63
  3.4 本章小结  63-64
  参考文献  64-66
第4章 NA 抑制活性肽抗病毒作用研究  66-76
  引言  66
  4.1 材料与仪器  66-67
    4.1.1 实验材料  66
    4.1.2 实验试剂  66-67
    4.1.3 主要仪器  67
  4.2 实验方法  67-69
    4.2.1 鳕鱼皮胶原蛋白的提取  67
    4.2.2 鳕鱼皮 NA 抑制粗酶液的制备  67
    4.2.3 蛋白质浓度的测定  67-68
    4.2.4 细胞毒性实验  68
    4.2.5 细胞病变抑制实验  68
    4.2.6 NA 抑制活性肽作用方式研究  68
    4.2.7 HA 实验  68-69
    4.2.8 统计学分析  69
  4.3 结果与分析  69-72
    4.3.1 细胞毒性实验  69
    4.3.2 活性肽对流感病毒的抑制作用  69-70
    4.3.3 NA 抑制活性肽抗流感病毒作用方式研究  70-72
    4.3.4 HA 实验结果  72
  4.4 本章小结  72-74
  参考文献  74-76
全文总结  76-77
致谢  77-78
个人简历  78
学术论文及专利  78-79

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