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大鲵虹彩病毒病病原的分离、鉴定、基因组测序及大鲵群体遗传多样性分析

作　者: 孟彦
导　师: 谢从新; 曾令兵; 肖汉兵
学　校: 华中农业大学
专　业: 渔业资源
关键词: 大鲵 虹彩病毒 分离、鉴定 检测方法 基因组测序 微卫星 遗传多样性
分类号: S947.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


大鲵(Chinese giant salamander, Andrias davidianus)是我国重要的珍稀保护动物与特种养殖对象。近年来,随着大鲵养殖规模的不断扩大、养殖集约化程度的不断提高以及苗、种交流的日益频繁,大鲵的病害问题日益突出。大鲵虹彩病毒病作为新出现的病毒性疾病,对大鲵养殖业危害十分严重,已经造成巨大的经济损失。本研究对大鲵虹彩病毒病的病原进行了分离、鉴定,分析了病毒的理化特性,建立了病毒的检测方法,并且对病毒的基因组进行了测序及分析。同时,应用微卫星标记对大鲵群体的遗传多样性进行了分析。研究的主要结果如下：1.大鲵虹彩病毒病病原的分离、鉴定从全身水肿,腹部有出血点的幼鲵以及全身性体表出血、吻端或四肢末端溃烂的成鲵体内成功分离到一株病毒。对感染组织进行病理切片发现,患病大鲵肾脏、肝脏、脾脏和肠道受损明显,肝组织脆性增加、表面多出血点,肾脏细胞空泡变性；脾缩小,淋巴细胞减少且坏死,并在其内发现类似病毒的包涵体。病变组织的过滤匀浆液可使鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)产生病变；对感染的组织和出现病变的EPC细胞电镜观察结果表明,细胞的线粒体变形,嵴断裂,粗面内质网扩张,细胞核破碎,染色质浓缩,细胞质内有空泡,并且可见晶格状排列、直径约140nm具典型虹彩病毒形态学特征的病毒粒子。人工回归感染实验表明,该病毒导致健康大鲵出现与自然发病大鲵相同的症状,表明其为致病病原；克隆病毒主衣壳蛋白基因(MCP)全序列并进行序列分析,结果显示该序列与虹彩病毒科蛙病毒属病毒的相似性在98%以上。结合组织病理、细胞培养、电镜观察、感染试验以及分子生物学鉴定,证明导致大鲵患病的病原为虹彩病毒科蛙病毒属病毒,命名为大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus, GSIV)。2.大鲵虹彩病毒理化与生物学特性研究及检测方法建立采用常规的病毒理化与生物学特性研究方法,对该病毒的培养滴度、病毒对热、酸碱度、有机溶剂、胰蛋白酶的敏感性以及病毒增殖特性与最适培养温度等进行了研究。结果表明,大鲵虹彩病毒的病毒滴度TCID50/0.1mL为109.8540.48；病毒对pH3和10的酸、碱敏感；在56℃热处理30min后病毒被灭活；胰蛋白酶处理后病毒滴度显著下降；在25℃条件下病毒在EPC细胞中增殖迅速,在感染细胞6h后病毒开始增殖,72h后进入平台期。病毒的理化性质与已知虹彩病毒理化特性相符。针对病毒MCP基因,分别建立了普通PCR、巢氏PCR、荧光定量PCR、多克隆抗体和环介导的等温扩增(LAMP)共5种检测方法,通过对5种检测方法各自反应条件的优化以及对不同来源病毒进行检测验证,结果证明这5种方法都可以有效地检测大鲵虹彩病毒,可以作为大鲵虹彩病毒病原的检测方法。其中,荧光定量PCR和LAMP法检测的灵敏度高达10-9模板DNA稀释度,可以对微量病毒进行检测。3.大鲵虹彩病毒全基因组测序及序列分析基于De Novo测序技术,利用Illumina公司的HiSeq基因组分析仪(Illumina HiSeq2000)对大鲵虹彩病毒进行全基因测序。测序结果显示病毒基因组全长104373bp, GC含量为55.2%,有95个开放阅读框(ORFs),编码蛋白所含的氨基酸个数从49到1294个不等,分子量大小在5.2-140.9kDa之间；在基因组40219-40314nt位置有48个CA重复序列；将大鲵虹彩病毒基因组的ORFs与其它已知虹彩病毒基因组的ORFs进行比较显示,大鲵虹彩病毒病毒基因组有41个ORFs与普通产婆蟾蛙病毒(common midwife toad ranavirus, CMTV)最为相似,而且基因组点阵分析也显示大鲵虹彩病毒基因组与CMTV病毒最为相似。将大鲵虹彩病毒的26个核心基因与15株已知虹彩病毒基因组的26个核心基因进行比较,按照大鲵虹彩病毒编码蛋白的氨基酸排列顺序进行串联,构建系统进化树,进化树结果显示虹彩病毒各属成员分别聚类,感染同类宿主的病毒成员有聚在一起的趋势;大鲵虹彩病毒与蛙病毒属成员聚在一类,且与CMTV病毒关系最近。4.大鲵微卫星引物开发及遗传多样性分析利用磁珠富集法开发了大鲵微卫星引物70对。利用其中10对引物对野生和人工繁殖的大鲵群体遗传多样性进行分析。结果表明其中7对引物在研究群体中有多态,观察等位基因个数在6-9个之间,多态信息含量(polymorphism information content, PIC)从0.3750-0.8751不等,大部分都属于高度多态。比较而言,野生群体等位基因数量高于人工繁殖群体,人工繁殖群体存在一定的等位基因丢失现象,并且遗传多样性水平低于野生群体。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-13
縮略语  13-15
第一章 文献综述  15-47
  1 大鲵疾病现状  15-20
    1.1 真菌性疾病  16
    1.2 大鲵细菌性疾病  16-19
    1.3 大鲵病毒性疾病  19-20
  2 虹彩病毒研究进展  20-28
    2.1 虹彩病毒的分类  20-21
    2.2 虹彩病毒的形态特征与结构  21-24
    2.3 虹彩病毒的理化性质  24-25
    2.4 虹彩病毒的分子特性  25-28
  3 蛙病毒的研究进展  28-40
    3.1 蛙病毒引起的两栖类动物疾病  28-31
    3.2 症状及引起的组织病理学变化  31
    3.3 蛙病毒的分离与检测方法  31-34
      3.3.1 电镜技术  31-32
      3.3.2 细胞培养技术  32-33
      3.3.3 免疫学检测技术  33-34
    3.4 分子生物学检测  34-37
    3.5 蛙病毒病的发病机制及防控  37-40
  4. 虹彩病毒全基因组测序  40-43
    4.1 基因组测序方法  41-43
    4.2 虹彩病毒基因组测序概况  43
  5 大鲵遗传多样性的研究  43-44
  6 选题的目的与意义  44-47
第二章 大鲵虹彩病毒病病原的分离与鉴定  47-64
  1 前言  47
  2 材料与方法  47-52
    2.1 材料  47-49
      2.1.1 实验动物  47-48
      2.1.2 细胞系  48
      2.1.3 试剂与耗材  48
      2.1.4 仪器设备  48-49
    2.2 实验方法  49-52
      2.2.1 病鲵寄生虫检查与细菌分离  49
      2.2.2 病鲵组织匀浆液的制备  49
      2.2.3 细胞培养与病毒分离  49-50
      2.2.4 人工感染试验  50
      2.2.5 组织病理学观察  50-51
      2.2.6 电镜观察  51
      2.2.7 病毒主衣壳蛋白基因的克隆及构建进化树  51-52
  3 结果  52-61
    3.1 症状  52-53
    3.2 寄生虫检查与细菌分离  53-54
    3.3 病毒培养与分离  54-55
    3.4 人工感染试验  55
    3.5 组织病理学观察  55-58
    3.6 电镜观察  58-59
    3.7 MCP基因克隆及进化树构建  59-61
  4 讨论  61-64
第三章 大鲵虹彩病毒特性分析及检测方法建立  64-84
  1 前言  64
  2 材料与方法  64-71
    2.1 材料  64-65
      2.1.1 病毒与细胞系  64-65
      2.1.2 试剂  65
    2.2 实验方法  65-67
    2.3 病毒的检测方法  67-71
      2.3.1 病毒扩增及基因组DNA提取  67
      2.3.2 病毒的检测  67-71
  3 结果  71-81
    3.1 病毒理化特性及生物学特性分析  71-75
      3.1.1 病毒滴度测定  71
      3.1.2 热敏感性试验  71-72
      3.1.3 酸碱度敏感性试验  72
      3.1.4 有机溶剂敏感性试验  72
      3.1.5 胰蛋白酶敏感性试验  72
      3.1.6 病毒的细胞敏感性试验  72-73
      3.1.7 病毒最适生长温度  73-74
      3.1.8 病毒的增殖  74
      3.1.9 病毒形态的观察  74-75
    3.2 病毒的检测  75-81
      3.2.1 PCR检测  75
      3.3.2 巢氏PCR检测  75-76
      3.3.3 Taqman荧光定量PCR检测  76-77
      3.3.4 间接免疫荧光检测  77-78
      3.3.5 LAMP检测  78-81
  4. 讨论  81-84
第四章 大鲵虹彩病毒基因组测序及分析  84-99
  引言  84
  4.1 材料和方法  84-86
    4.1.1 材料  84
    4.1.2 方法  84-86
  4.2 结果与分析  86-96
    4.2.1 病毒基因组特征  86-87
    4.2.3 病毒基因组序列结构  87-93
    4.2.4 病毒的点阵分析  93-94
    4.2.5 病毒基因组中的重复序列  94
    4.2.6 系统进化树  94-96
  4.3 讨论  96-99
第五章 大鲵遗传多样性分析  99-111
  1 前言  99-100
  2 材料与方法  100-106
    2.1 材料  100
    2.2 基因组DNA提取  100-101
    2.3 磁珠富集法开发微卫星引物  101-105
    2.4 利用微卫星引物进行多态性分析  105-106
  3 结果  106-109
    3.1 微卫星引物分离  106
    3.2 大鲵遗传多样性分析  106-109
  4 讨论  109-111
主要研究结果  111-112
附录Ⅰ  112-116
参考文献  116-131
在读期间发表的相关论文  131-132
致谢  132

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 其他水产病虫害及其防治 > 大鲵
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