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甲型H1N1流感病毒介导小鼠肺炎的相关miRNA的筛选与功能分析

作　者: 薛文仲
导　师: 孙岩松; 宋宏彬
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 流感病毒 H1N1 miRNA mRNA 基因芯片
分类号: S858.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

流行性感冒是由流感病毒引起的具有高度传染性的急性呼吸道疾病，具有传播广、发病急、危害大等流行病学特点。大量研究表明，流感病毒介导的肺部炎性损伤是引起死亡的重要原因，对严重病例的病理研究和动物实验确认后发现2009年甲型H1N1流感病毒具有直接导致严重肺炎的能力。以往研究发现，流感病毒介导肺部炎症的严重程度与宿主补体激活和病毒诱导的细胞因子风暴密切相关，miRNA在肺炎的发生发展过程中可能起着重要的调控作用，但目前流感病毒所致肺炎的免疫机制并不清楚，尤其是miRNA在该过程中的调控作用尚未见深入研究。为此，我们利用两株甲型H1N1流感病毒分别建立小鼠动物模型，通过miRNA芯片和mRNA芯片，深入探讨宿主miRNA在流感病毒介导肺部免疫炎性损伤中的调控机制，为进一步揭示流感病毒的致病机制奠定基础。首先，我们利用甲型H1N1流感毒株A/Beijing/501/2009(H1N1（)简称BJ501)与A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)（简称PR8)建立小鼠流感病毒肺炎模型。通过对体征的观察及体重、肺指数、病理、细胞因子、补体分子、粘附分子的检测，发现模型均符合流感样症状，体重在第7天降到最低，肺指数PR8组在第7d、BJ501组在第9天达到峰值，病理出现明显肺炎表现，炎症介质表达也明显上调。两组对比发现PR8组体重降低程度、肺指数升高程度、组织病变程度及C3aR、IL6、VCAM-1、IFN-γ、TNF-α在第5天的表达程度，都显著高于BJ501组。结果表明，我们成功建立了这两种流感毒株的小鼠肺炎模型，且PR8毒株导致的肺部炎症损伤程度要略重于BJ501毒株。然后我们利用miRNA芯片分别检测了小鼠感染流感病毒后第2天（早期，n=3）和第5天（中期，n=3）肺组织中miRNA的表达变化情况。与PBS组相比的结果发现：在第2天PR8组有10个miRNA表达上调，没有表达下调的，在第5天时有36个miRNA表达上调、6个表达下调；BJ501组第2天有4个miRNA表达上调、2个miRNA表达下调，在第5天有22个miRNA表达上调、3个表达下调。两模型组第2天、第5天分别与PBS组对比及组内对比结果发现在PR8组发生特异变化的miRNA有46个，在BJ501组发生特异变化的有40个，其中有30个miRNA在PR8组和BJ501组均发生显著变化，这其中28个上调，2个下调，主要包括miR-155、miR-130b、miR-21、miR-2137、miR-1949、miR-468、miR-574-3p、miR-145、miR-24-2*等；以往的研究证明，miR-155、miR-468、miR-145、miR-24-2参与了免疫调控并在炎症反应过程中发挥作用。其中miR-468在相同时间点PR8组都高表达于BJ501组，提示miR-468可能是在相同时间点PR8组炎症反应都强于BJ501的一个重要原因。我们的结果表明miRNA数量及表达情况随着小鼠肺炎症程度的增加均发生差异变化，不同的毒株引起的miRNA变化的情况也不相同。该结果再次证明了宿主miRNA的表达变化参与了流感病毒介导的肺部炎症的免疫损伤。同样，我们对小鼠感染流感病毒后第2天（早期，n=3）和第5天（中期，n=3）肺组织中mRNA表达谱的变化情况进行了检测。在流感病毒感染后的第2天，PR8组有106个基因表达上调，120个基因表达下调，BJ501组有216个基因表达上调，19个基因表达下调；在感染后的第5天，PR8组有1439个基因表达上调、560个基因表达下调，BJ501组有1177个基因表达上调、553个基因表达下调。进一步分析发现，感染病毒后，肺组织中细胞因子、补体分子及粘附分子如：IL6、CXCL11、CXCL10、TNF、IFN、C3aR、C5aR、CD62P、VCAM-1等均发生了显著变化，该结果与我们动物模型建立过程中对IL6、TNF-α、IFN-γ、C3aR、C5aR、CD62P、VCAM-1的定量PCR结果相一致。同时我们通过Western-blot的方法在蛋白水平对CD62P和C4两个基因进行了验证，与芯片结果完全一致。该结果表明不同病毒株之间、随着炎症程度的增加，宿主mRNA的表达谱发生了显著的变化，细胞因子、补体及粘附分子均参与了流感介导的肺部免疫损伤。通过Pathway和GO分析发现，肺组织中发生显著变化的基因主要参与了细胞生理过程、调控细胞代谢、免疫进程等方面。在炎症调控过程中主要参与细胞因子与细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、补体与凝血级联（Complement and coagulation cascades）、JAK-STAT、MAPK、细胞凋亡（Apoptosis）等信号通路，且炎症较重的PR8组有更多的靶基因参与调控炎症相关通路。利用perl代码与Sanger和TargetScan数据库，将miRNA和mRNA数据相结合，根据负调控的原则进行靶基因分析，结果发现PR8组和BJ501组分别有24个和21个miRNA在mRNA表达谱中检测到了靶基因，其中有16个为这两组共有的miRNA，他们是miR-130b、miR-132、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-145、miR-155、miR-188-5p、miR-18a、miR-21、miR-223、miR-24-2*、miR-449a、miR-468、miR-574-5p、miR-706、miR-7a。PR8组特异的miRNA是miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-142-5p、miR-20*、miR-30d、miR-680、miR-877*，BJ501组特异的miRNA是miR-125a-3p、miR-126-5p、miR-142-3p、miR-574-3p、miR-671-5p。对取得关联miRNA的靶基因进行生物信息学分析，发现他们与炎症相关细胞信号通路相关。在细胞凋亡、补体与凝血级联通路中，发现部分miRNA抑制细胞信号通路，而部分miRNA激活信号通路。如miR-223、miR-130b、miR-24-2*激活细胞凋亡信号通路而miR-155抑制该通路；miR-145可以抑制补体与凝血级联通路的激活，而miR-24-2*激活此通路，miR-574-3p先抑制后激活此通路。另外，PR8组的miR-30d持续激活C1R，导致补体通路激活，却又通过激活SERPINE1抑制补体通路，还通过激活靶基因SOCS-3，负向调节IL-6。这体现了miRNA对信号通路调节的多样性和预示病毒与宿主相互作用达到平衡状态，并提示同一个miRNA在相同的信号通路中具有相反的作用。在细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路中，PR8组较BJ501组更多的miRNA（miR-30d、miR-1、miR-133a、miR-133b）通过激活IL6、IL21R、TNF、CXCL11等基因，使得信号通路激活。提示miRNA的差异可能是导致PR8介导的炎症严重于BJ501的原因之一。芯片结果发现BJ501组miR-574-3p在第5天激活C5aR，该结果与我们动物模型建立过程中对C5aR的定量PCR结果相一致，提示miR-574-3p的调节可能是导致BJ501组C5aR在第5天高表达于PBS组的原因之一。作为各种炎症分子的上游调节者的miRNA，深入对他们在炎症反应方面的研究，必将有助于深入阐明流感病毒所致肺炎的免疫机制，而且可以为新型治疗药物的研发奠定基础。

全文目录

缩略词  5-6
摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-18
  1 流感病毒的特征与危害  13-14
  2 2009 年甲型 H1N1 流感病毒可以直接导致严重肺部炎症反应  14
  3 miRNA 与肺炎研究的进展  14-15
  4 病毒与宿主 miRNA 研究进展  15
  5 甲型 H1N1 流感病毒与宿主 miRNA 研究进展  15-17
  6 miRNA 与炎症相关信号通路  17
  7 本论文研究目的与意义  17-18
第一章两种甲型 H1N1 流感病毒介导小鼠肺炎模型的建立与炎症比较  18-31
  实验 1 甲型 H1N1 流感病毒的培养  18-22
    1 材料及仪器  18
    2 方法与步骤  18-21
    3 结果  21
    4 讨论  21-22
  实验 2 PR8 与 BJ501 介导的小鼠肺炎模型的建立与炎症比较  22-31
    1 材料及仪器  22
    2 方法与步骤  22-26
    3 结果  26-29
    4 讨论  29-31
第二章甲型 H1N1 流感病毒介导小鼠肺炎的相关 miRNA 的筛选与功能分析  31-69
  实验 1 Agilent 芯片检测甲型 H1N1 流感病毒介导小鼠肺炎模型 miRNA 表达谱  31-40
    1 材料  31
    2 方法与步骤  31-32
    3 结果  32-38
    4 讨论  38-40
  实验 2 Affymetrix 芯片检测甲型 H1N1 流感病毒介导小鼠肺炎模型 mRNA 表达谱  40-50
    1 材料  40
    2 方法与步骤  40
    3 结果  40-49
    4 讨论  49-50
  实验 3 Wester-blot 检测肺组织中沉积的 C4d 及 CD62P 表达水平变化  50-56
    1 材料及仪器  50-51
    2 方法与步骤  51-54
    3 结果  54
    4 讨论  54-56
  实验 4 miRNA 与 mRNA 表达谱差异基因的关联及功能分析  56-69
    1 数据  56
    2 方法  56
    3 结果  56-66
    4 讨论  66-69
结论  69-71
参考文献  71-75
综述  75-85
  参考文献  81-85
个人简历  85-87
致谢  87

甲型H1N1流感病毒介导小鼠肺炎的相关miRNA的筛选与功能分析

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