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基因C型鸭甲肝病毒PCR检测方法的建立及动态定量分布

作　者: 黄秋雪
导　师: 汤承; 岳华
学　校: 西南民族大学
专　业: 预防兽医
关键词: 基因C型鸭甲肝炎病毒 分离鉴定 双重RT-PCR 荧光定量RT-PCR 动态分布
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


近年来，由基因C型鸭甲肝病毒引起的鸭病毒性肝炎广泛流行于中国和韩国，严重影响养鸭业的发展。DHAV-C的流行病学特点、临床症状和病理变化与DHAV-A非常相似，所引起的DVH难以鉴别。因此，对DHAV-C的快速诊断进行研究具有重要意义。本研究针对四川省主要养鸭区鸭场流行DVH进行病原分离鉴定，建立检测DHAV-C与DHAV-A的双重RT-PCR方法和检测DHAV-C的实时荧光定量PCR方法，并对DHAV-C在雏鸭体内的动态分布进行研究。主要取得如下成果：1证实当前四川省鸭病毒性肝炎的优势流行株主要为基因C型鸭甲肝病毒。本试验从2009年11月至2011年7月采自四川省邛崃、郫县、双流、广汉等主要养鸭区10个商品肉鸭场的24份疑似感染鸭病毒性肝炎，且以肝脏和肾脏肿大、出血为病变特征的病鸭肝脏中分离得到16株病毒。经RT-PCR鉴定证实16株病毒分离株均属基因C型鸭甲肝病毒（DHAV-C）。此外，随机选择的4个临床分离毒株能复制出与临床自然发病鸭相同的临床症状和病理变化。这结果证实DHAV-C是当前导致四川省鸭病毒性肝炎的主要原因。2成功建立了检测鸭甲肝病毒基因A型和基因C型的双重RT-PCR方法。DHAV-C在流行病学特点、临床症状和病理变化与DHAV-A非常相似，只有借助实验室检测才能区别。本试验根据GenBank中DHAV-A和DHAV-C全基因组序列，针对DHAV-A的3C、3D和DHAV-C的2C区域分别设计了2对引物，建立了检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法。该方法能分别从DHAV-A、DHAV-C阳性样本中扩增出相应的特异片段，而不与其它被检的无关病原发生非特异反应；对DHAV-A和DHAV-C的最低检出限分别为4.98×104拷贝数/μL（6.3fg）、1.68×104拷贝数/μL（3.4fg）；对2007年4月至2011年7月疑似鸭病毒性肝炎的病料中检出DHAV-A和DHAV-C的阳性率分别为20%（14/70）、70%（49/70）；随机抽取的16份DHAV-C PCR阳性样本的病毒分离结果与双重RT-PCR检测结果的相符合。本研究结果显示，建立的双重RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可直接用于DHV-A或DHAV-C临床组织样本的检测，为DHV的临床快速鉴别诊断提供了有利工具。3首次建立了检测基因C型鸭甲肝炎病毒实时荧光定量PCR方法目前国内外尚未见检测DHAV-C的实时荧光定量PCR方法报道。本试验针对DHAV-C的2C区域设计引物，成功建立了检测DHAV-C的实时荧光定量PCR方法。结果显示该方法具有良好的特异性，能从DHAV-C阳性样本中扩增出相应的特异片段，而不与其它被检的无关病原发生非特异反应；具有良好的稳定性，批间变异系数和批内变异系数范围分别为1.02%～1.77%和0.15%～2.0%；扩增效率为97.9%；在1.68×104～1.68×109拷贝/μL内有良好的线性关系；最低检出限为1.68×103拷贝数/μL；熔解曲线分析显示为单一的特异峰，没有非特异性扩增和引物二聚体。对38份疑似鸭病毒性肝炎的临床样本进行检测，结果表明22份样本为DHAV-C阳性，其他16份DHAV-C阴性样本随后被鉴定为DHAV-A，这一结果进一步被病毒分离结果证实。该方法具有良好的特异性和敏感性，合适用于临床样本的快速检测，同时也为鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查提供了快速、敏感、特异的新方法。4完成基因C型鸭甲肝炎病毒在雏鸭体内的动态定量分布。采用本试验建立的DHAV-C荧光定量PCR检测方法，对DHAV-C感染后l h、6h、12h、18h、24h、48h及72h在SPF雏鸭体内各个组织器官中的病毒荷载量进行了动态定量分析，结果显示感染后12h，DHAV-C在肝脏中最早检出，并且保持着高水平的病毒荷载量，表明肝脏是病毒检测及分离的良好采样部位。感染后24h在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊、胸腺、胰、脑、小肠等组织器官中均能检出病毒且荷载量高，这些结果为研究其致病性及防治提供有价值的参考。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-11
第一篇研究报告  11-45
  第一章 基因 C 型鸭甲肝炎病毒的分离鉴定  11-20
    1 材料和方法  11-15
      1.1 病料、毒株、鸭胚和实验动物  11-12
      1.2 主要试剂  12
      1.3 主要仪器  12
      1.4 病毒分离培养  12
      1.5 病毒分离培养物的 RT-PCR 鉴定  12-14
        1.5.1 样本总RNA的提取  12-13
        1.5.2 cDNA的合成  13
        1.5.3 RT-PCR 鉴定  13
        1.5.4 病毒分离培养  13-14
      1.6 RT- PCR 产物序列测定与遗传进化分析  14
      1.7 排它性试验  14-15
      1.8 人工感染试验  15
    2 结果  15-19
      2.1 病毒分离培养结果  15-16
      2.2 病毒鉴定结果  16-18
      2.3 DHAV 分离毒株的遗传进化分析  18
      2.4 人工感染试验  18-19
    3 讨论  19-20
  第二章 鸭甲肝病毒基因 A 型和 C 型双重 RT-PCR 检测方法的建立  20-29
    1 材料与方法  20-24
      1.1 毒（菌）株、鸭胚和病料来源  20-21
      1.2 主要试剂  21
      1.3 主要仪器  21
      1.4 引物设计  21-22
      1.5 病毒 RNA 提取及 cDNA 合成  22
      1.6 引物的特异性  22
      1.7 阳性标准品的制备  22
      1.8 双重 RT-PCR 检测方法的建立  22-23
      1.9 双重 RT-PCR 方法的特异性试验  23
      1.10 双重 RT-PCR 方法的灵敏度试验  23-24
      1.11 双重 RT-PCR 方法检测临床样品  24
    2 结果  24-27
      2.1 引物的特异性  24
      2.2 优化的双重 RT-PCR 反应条件  24-26
      2.3 双重 RT-PCR 的特异性  26
      2.4 双重 RT-PCR 的灵敏度  26-27
      2.5 对临床样本的检测  27
    3 讨论  27-29
  第三章 基因 C 型鸭甲肝炎病毒实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立  29-39
    1 材料和方法  29-33
      1.1 毒株、菌株、鸭胚和临床样本来源  29-30
      1.2 主要试剂  30
      1.3 主要仪器  30-31
      1.4 引物设计与合成  31
      1.5 病毒总 RNA 的提取及 cDNA 的合成  31
      1.6 标准品的制备  31-32
      1.7 DHAV-C 实时荧光定量 RT-PCR 方法的建立  32-33
      1.8 应用 DHAV-C 实时荧光定量 RT-PCR 方法对临床病料进行检测和验证  33
    2 结果  33-38
      2.1 引物的特异性  33-34
      2.2 优化的实时荧光定量 RT-PCR 条件结果  34-35
      2.3 建立的实时荧光定量 RT-PCR 方法的标准曲线分析  35-36
      2.4 实时荧光定量 RT-PCR 方法的特异性  36
      2.5 实时荧光定量 RT-PCR 方法的重复性和再现性  36
      2.6 对临床样本的检测  36-38
    3 讨论与小结  38-39
  第四章 基因 C 型鸭甲肝炎病毒在雏鸭体内的动态定量分布  39-44
    1 材料和方法  39-40
      1.1 毒株和实验动物  39
      1.2 主要试剂  39
      1.3 主要仪器  39-40
      1.4 动物分组及处理  40
      1.5 样品总 RNA 的抽提及 cDNA 的合成  40
      1.6 样品的检测  40
      1.7 数据处理  40
    2 结果  40-43
      2.1 人工感染雏鸭的临床症状及剖检变化  40-41
      2.2 DHAV-C 在雏鸭体内的的动态定量分布  41-43
    3 讨论  43-44
  第五章 结论与创新点  44-45
    1 本论文的结论  44
    2 本论文的创新点  44
    3 本论文的不足  44-45
第二篇 文献综述  45-53
  基因 C 型鸭甲肝病毒的分子生物学研究进展  45-53
    1. 鸭肝炎病毒的分类  45
    2.新型病毒性肝炎的发现  45-46
    3. 小 RNA 肝炎病毒的基因分析  46
    4. 基因 C 型鸭甲肝病毒的基因组结构  46-48
    5. 基因 C 型鸭甲肝病毒的基因序列分析  48-49
    7. 展望  49-50
    参考文献  50-53
附录  53-54
致谢  54-55

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸭
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