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农杆菌介导的枣树遗传转化研究

作　者: 郝征
导　师: 刘孟军; 赵锦
学　校: 河北农业大学
专　业: 果树学
关键词: 冬枣 疯组培苗 遗传转化 Bt基因 蛋白抑制剂基因 根癌农杆菌 发根农杆菌 枣疯病抗性
分类号: S665.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 119次
引　用: 3次
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内容摘要


枣树(Ziziphus jujuba Mill.)是我国原产重要果树。枣树由于花小、人工去雄难、坐果率低且胚败育现象严重,使得其杂交育种非常困难。枣疯病是由植原体引起致死性传染病害,几乎分布于国内外所有枣区,绝大多数枣树品种都对其敏感,已成为制约枣产业发展的严重障碍。随着生物技术的不断发展,基因工程已成为现代植物改良育种的有效手段。本研究旨在探索建立农杆菌介导的枣树遗传转化体系,并利用发根农杆菌提高枣树对枣疯病的抗性,为枣树遗传改良和枣疯病防治提供技术支撑。主要研究结果如下:1.建立了冬枣的花药再生体系。诱导花药愈伤的适宜培养基为1/2MS+1.0mg/L 2,4-D+20g/L麦芽糖+5.5g/L琼脂;花药愈伤的适宜增殖培养基为MS+0.4mg/L TDZ+0.1mg/L NAA +20g/L麦芽糖+5.5g/L琼脂;1.0mg/L TDZ和0.4mg/L NAA的组合是诱导冬枣花药愈伤出芽的适宜生长调节剂组合,诱导出芽率达100%,平均出芽数为3.9个/块;0.2mg/L BA、0.1mg/L IBA和1.5g/L PVA是玻璃苗恢复的适宜组合,玻璃苗恢复率为48.9%;在添加1.5mg/L IAA的生根培养基中,生根率最高(43.3%),根长最长(4.2cm)。2.首次建立了月光枣的花药再生体系。诱导花药愈伤的适宜培养基为1/2MS+1.0mg/L 2,4-D+20g/L麦芽糖+5.5g/L琼脂;月光花药愈伤的适宜增殖培养基为MS+0.6mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+20g/L麦芽糖+5.5g/L琼脂。适宜月光愈伤分化出芽的培养基为:MS+5.5g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0.8mg/L TDZ+4.0mg/L AgNO3。其诱导出芽率为100%,平均出芽数为10.4个/块;在培养基MS+5.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.2mg/L BA+0.1mg/L IBA+1.5g/L PVA中玻璃苗可恢复成正常苗;添加2.0mg/L IBA的生根培养基中月光生根率最高;GA3的添加对于枣愈伤的生长和玻璃苗的恢复均为抑制作用。3.建立了根癌农杆菌介导的冬枣叶片遗传转化体系。适宜的遗传转化条件为:根癌农杆菌的OD600为0.8,侵染20min后,在共培养基MS+5.5g/L琼脂+20g/L麦芽糖+1.0mg/L TDZ+0.1mg/L IBA+200μM AS(pH5.8)中暗培养3d。首次将双抗虫基因(Bt基因和蛋白抑制剂基因API)转入冬枣中,得到了8个转基因株系。4.建立了冬枣叶片及冬枣疯组培苗的发根农杆菌介导的遗传转化体系。冬枣叶片诱导毛根的适宜条件是在菌液浓度OD600为0.8时侵染叶片20min,在共培养基1/2MS+4.0mg/L IBA+5.5g/L琼脂+30g/L蔗糖(pH5.8)中暗培养3-5d,然后转接入培养基1/2MS0+CRO100mg/L中,光照条件为光照/黑暗为14/10h。冬枣疯组培苗茎段诱导出毛根的适宜条件为:在菌液中添加50μM的AS预活化1~2h,OD600为0.8侵染5~10min,共培养5d,共培养基为MS+5.5g/L琼脂+20g/L蔗糖+100mg/L CRO,光照条件为光照/黑暗为14/10h。首次通过发根农杆菌侵染使冬枣疯组培苗转化为正常植株,得到了30个抗病性提高的转健苗株系。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章 引言  12-27
  1 枣树组织培养研究现状  12-15
    1.1 花药培养  12-13
    1.2 营养器官组织培养  13
    1.3 愈伤组织培养  13-14
    1.4 胚乳、胚培养  14
    1.5 原生质体培养  14
    1.6 体细胞胚的发生途径  14-15
  2 果树遗传转化研究进展  15-18
    2.1 果树遗传转化的方法  15-17
    2.2 影响果树遗传转化的主要因素  17-18
  3 Bt 基因和蛋白酶抑制剂基因及其转化研究进展  18-21
    3.1 Bt 基因及其杀虫晶体蛋白的分子结构、功能和杀虫机理  18-19
    3.2 转Bt 基因植物的培育  19
    3.3 转Bt 基因植物及其应用中存在的问题及其对策  19-20
    3.5 转蛋白酶抑制剂基因植物的培育  20-21
  4 发根农杆菌在转基因植物中的研究和应用  21-24
    4.1 发根农杆菌和Ri 质粒  21
    4.2 发根农杆菌诱导毛状根形成的机制  21-22
    4.4 发根农杆菌的应用  22-24
  5 枣疯病研究进展  24-25
  6 本研究的目的和依据  25-27
第二章 枣花药愈伤再生体系的建立  27-48
  1 材料和方法  27-32
    1.1 材料  27
    1.2 方法  27-32
  2 结果与分析  32-47
    2.1 不同植物生长调节剂对诱导枣花药愈伤的影响  32-33
    2.2 不同浓度TDZ 对枣花药愈伤增殖的影响  33-35
    2.3 不同浓度TDZ 对枣花药愈伤再生不定芽的影响  35
    2.4 NAA 对枣花药愈伤再生不定芽的影响  35-36
    2.5 GA_3 对枣花药愈伤再生不定芽及不定芽伸长的影响  36-38
    2.6 AgN0_3 对枣花药愈伤再生不定芽的影响  38-40
    2.7 GA_3 对玻璃苗恢复的影响  40-41
    2.8 不同植物生长调节剂对再生苗生根的影响  41-43
    2.9 生根植株移栽  43-44
    2.10 再生苗的倍性鉴定  44
    2.11 再生苗的AFLP 检测  44-47
  3 讨论  47
    3.1 TDZ、NAA、GA_3 以及AgN0_3 对枣花药壁愈伤再生不定芽的影响  47
    3.2 玻璃苗的恢复  47
  4 小结  47-48
第三章 根癌农杆菌介导的冬枣遗传转化体系的建立  48-64
  1 材料和方法  48-53
    1.1 试验材料  48
    1.2 试验条件  48-49
    1.3 试验方法  49-53
  2 结果与分析  53-61
    2.1 Carb 和CRO 对根癌农杆菌的抑菌效果  53
    2.2 抗生素Carb 和CRO 对冬枣叶片再生的影响  53-54
    2.3 Km 选择压浓度的确定  54-56
    2.4 影响根癌农杆菌遗传转化效果的因素  56-59
    2.5 抗性愈伤和抗性芽再生成苗  59-60
    2.6 抗性苗的PCR 检测  60-61
  3 讨论  61-63
    3.1 抗生素的抑菌效果和对冬枣叶片离体再生出芽的影响  61
    3.2 影响根癌农杆菌介导冬枣叶片遗传转化的主要因素  61-63
  4 小结  63-64
第四章 发根农杆菌介导的枣树遗传转化体系的建立  64-91
  1 材料和方法  64-71
    1.1 试验材料  64
    1.2 试验条件  64-65
    1.3 试验方法  65-66
    1.4 毛根的继代  66-67
    1.5 利用发根农杆菌侵染冬枣疯苗诱导抗病性的影响因素  67
    1.6 再生转健苗的PCR 检测  67-69
    1.7 枣疯病病原的检测、鉴定  69-71
    1.8 微嫁接方法检测转化苗的抗病性  71
  2 试验结果与分析  71-88
    2.1 抗生素Carb 和CRO 对发根农杆菌的抑菌效果  71-72
    2.2 影响发根农杆菌遗传转化效果的因素  72-78
    2.3 毛根的继代  78-80
    2.4 利用发根农杆菌侵染冬枣疯苗茎段诱导其抗病性  80-83
    2.5 转健苗的PCR 检测  83-84
    2.6 再生转健苗植原体的检测  84-86
    2.7 转健苗抗病性的微嫁接验证  86-88
  3 讨论  88-89
    3.1 发根农杆菌介导冬枣遗传转化的影响因素  88-89
    3.2 影响冬枣疯苗转健的因素  89
  4 结论  89-91
参考文献  91-105
在读期间发表的学术论文  105-106
作者简历  106-107
致谢  107-108

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 杂果类 > 枣
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