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黄瓜离体再生和遗传转化体系的建立

作　者: 张若纬
导　师: 张宝玺
学　校: 中国农业科学院
专　业: 蔬菜学
关键词: 黄瓜离体再生根癌农杆菌遗传转化 GUS MiMPK1
分类号: S642.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

黄瓜是国内外广泛种植的一类重要蔬菜作物,在蔬菜周年化供应中具有重要作用,实际生产栽培中常因各种病虫的危害造成巨大的经济损失。由于传统病虫害防治方法的种种不利因素,因此,选育抗性品种从根本上提高黄瓜抗病虫能力,是防治的最佳途径。但是黄瓜种内抗性材料缺乏,传统育种很难获得突破。本研究以不同材料的黄瓜子叶、子叶节作外植体,研究了基因型、激素对黄瓜离体分化的影响,建立了高效的离体再生体系;同时研究了AS、侵染时间、PH值对黄瓜遗传转化的影响,优化了转化体系;在此基础之上,通过根癌农杆菌介导法,将GUS基因导入黄瓜,对转化体系进行了初步探索,并进一步将抗线虫基因MiMPK1导入黄瓜,为黄瓜遗传转化的相关研究提供理论依据。主要研究结果如下:1.基因型是植物离体再生能力高低的重要影响因素之一,不同基因型之间的再生能力差异很大。黄瓜子叶再生体系建立所用的6份材料（中农8号、吉林旱瓜选系、四川白瓜选系、Gy14、65G、9110Gt）中,华南类型材料吉林旱瓜的再生能力最强,在培养基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO₃上,再生频率和每外植体再生芽数分别为96.7 %和5.2;黄瓜子叶节再生体系的建立所用的8份材料（吉林旱瓜选系、四川白瓜选系、0513、228、Gy14、65G、185、K2148）之中,华南类型材料四川白瓜的再生能力最强,在培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO₃上,再生频率和每外植体再生芽数分别为100 %和6.4。2.植物激素是植物离体再生所必需,6-BA是黄瓜离体分化中最常用的植物激素之一。对于黄瓜子叶外植体的分化而言,6-BA是不定芽发生的主导因素,而ABA的添加能显著提高不定芽数目。美国加工类型材料Gy14和欧洲华北混合类型材料9110Gt的最佳诱芽培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA+2 mg/L AgNO₃;华南类型材料吉林旱瓜和四川白瓜的最佳诱芽培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO₃;欧洲温室类型材料65G的最佳诱芽培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA+2 mg/L AgNO₃;华北类型中农8号最佳诱芽培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO₃。对于黄瓜子叶节外植体的分化而言,培养基中仅附加6-BA即可得到很好的再生效果,不同材料对激素的敏感程度不同。材料228、185、65G的最佳诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO₃;材料四川白瓜、吉林旱瓜、K2148、0513的最佳幼芽培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO₃;GY14的最佳幼芽培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO₃。3.在黄瓜再生体系建立的基础之上,研究了子叶节对Km和Hyg的耐受性和敏感度,确定了含不同抗性基因载体的筛选剂浓度,Km的选择压为75 mg/L,Hyg的选择压浓度为10 mg/L。4.黄瓜遗传转化体系优化的结果表明,在预培养基、菌液、共培养基中添加AS能显著提高抗性芽数量,最佳浓度分别为250 ul/L、500 ul/L、250 ul/L;侵染时间为15 min时,外植体再生频率和抗性芽数最高;选择培养基pH较低时有利于外植体分化,以PH=5.40最佳。5.采用根癌农杆菌介导法将GUS基因转化黄瓜,对转化体系作初步探索。得到了Km抗性植株,取幼嫩叶片,经GUS组织化学染色,共有14株显示蓝色,表明GUS基因已整合到黄瓜基因组,并实现表达,初步统计阳性率为7.4 %。6.在遗传转化体系的优化和探索的基础之上,将抗线虫基因MiMPK1导入黄瓜,筛选获得了Hyg抗性植株。提取抗性植株的基因组DNA,经PCR检测,共有28株扩增出500 bp左右的特异条带,初步统计阳性率为5.3 %,为黄瓜的抗线虫病育种提供了理论依据。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-13
第一章文献综述  13-24
  1.1 黄瓜离体培养研究进展  13-17
    1.1.1 植物离体再生途径  13
    1.1.2 黄瓜离体培养的影响因素  13-17
  1.2 黄瓜遗传转化研究进展  17-22
    1.2.1 遗传转化的方法  17-18
    1.2.2 黄瓜遗传转化研究现状  18-22
  1.3 黄瓜遗传转化存在问题与展望  22-23
    1.3.1 黄瓜离体再生存在的问题  22
    1.3.2 黄瓜遗传转化存在的问题  22-23
    1.3.3 黄瓜遗传转化前景展望  23
  1.4 研究目的与意义  23-24
第二章黄瓜离体再生体系的建立  24-33
  2.1 材料与方法  24-26
    2.1.1 试验材料  24-25
    2.1.2 试验方法  25-26
  2.2 结果与分析  26-31
    2.2.1 激素对黄瓜离体再生的影响  26-29
    2.2.2 基因型对黄瓜离体再生的影响  29-31
    2.2.3 6-BA 对不定芽伸长的影响  31
    2.2.4 再生植株的生根  31
  2.3 结论与讨论  31-33
第三章黄瓜遗传转化体系的优化  33-40
  3.1 材料与方法  33-35
    3.1.1 试验材料  33
    3.1.2 试验方法  33-35
  3.2 结果与分析  35-38
    3.2.1 卡那霉素(Km)对外植体分化的影响  35
    3.2.2 预培养基中附加AS 对抗性芽再生的影响  35-36
    3.2.3 菌液中附加AS 对抗性芽再生的影响  36
    3.2.4 侵染时间对抗性芽再生的影响  36-37
    3.2.5 共培养基中附加AS 对抗性芽再生的影响  37
    3.2.6 选择培养基PH 对抗性芽再生的影响  37-38
  3.3 结论与讨论  38-40
第四章黄瓜遗传转化体系的初步探索和抗线虫基因MiMPK1 的转化  40-49
  4.1 材料与方法  40-44
    4.1.1 试验材料  40
    4.1.2 试验方法  40-44
  4.2 结果与分析  44-47
    4.2.1 潮霉素(Hyg)对外植体分化的影响  44
    4.2.2 抗性植株的获得  44-45
    4.2.3 基因组DNA 质量检测  45-46
    4.2.4 GUS 染色结果  46
    4.2.5 PCR 检测结果  46-47
  4.3 结论与讨论  47-49
第五章全文结论  49-50
参考文献  50-56
致谢  56-57
作者简历  57

黄瓜离体再生和遗传转化体系的建立

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