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葡萄microRNA及其靶基因的识别、鉴定及作用方式研究

作　者: 王晨
导　师: 房经贵
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄 miRNA 靶基因 小RNA文库 mRNA文库 生物信息学预测 miR-RACE Solexa测序 Degradome测序 qRT-PCR PPM-RACE和RLM-RACE 调控模式
分类号: S663.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


植物microRNA (miRNA)是广泛分布于植物基因组中的一类长度约19-24个核苷酸的内源非编码的单链小分子RNA,是植物基因表达的重要调节因子。它主要通过介导靶基因(靶)的裂解或抑制靶的翻译从转录后水平调控靶的表达,在植物的生长、发育、分化、凋亡、新陈代谢、应激反应等方面起着重要的调控作用。植物miRNA是植物功能基因组学研究的主要内容之一。葡萄(Vitis vinifera L.)是世界性重要水果,也是我国最重要经济果树之一。目前,尽管已有一些葡萄miRNA识别、鉴定的报道,但所有这些鉴定的葡萄miRNA均来自欧亚种的酿酒葡萄,而且这些欧亚种的不同品种中约30%同源miRNA存在序列差异。因此,在不同葡萄品种群与葡萄种上开展葡萄miRNA及其靶基因的识别、鉴定及作用方式研究对于更全面认识葡萄miRNA的特性,功能及葡萄种间的进化具有重要意义,也为葡萄功能基因组学的全面开展奠定了重要研究基础。本研究以欧美杂种(hybrid of V. vinifera and V. labrusca)的鲜食葡萄‘夏黑’(Summer x Black)和野生的山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)为试验材料,利用生物信息学预测、miR-RACE、Solexa测序、Degradome测序、RT-PCR、PPM-RACE和RLM-RACE技术以及等技术系统地开展了葡萄miRNA (Vv-miRNA)及其靶基因的鉴定与特征性分析,并研究了miRNA调控靶基因的主要作用方式以及作用方式的时空性。主要研究结果如下：1.利用miR-RACE技术在欧美杂种的鲜食葡萄品种‘夏黑’上验证了156条生物信息学预测的miRNAs的精确序列,并通过生物信息学方法预测了134条miRNAs的靶基因。进一步对随机选择的10对Vv-miRNAs及其靶基因在葡萄叶、茎、卷须、花序、花和果实六种不同组织中进行荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)表达分析,结果表明不同Vv-miRNAs及其靶基因在葡萄不同组织具有不同的表达水平,且二者的表达水平之间存在一定的负相关。同源miRNA的靶模式比较分析发现不同葡萄品种的同源Vv-miRNAs的碱基变异一般不改变其靶基因,葡萄与拟南芥中同源miRNA序列的碱基变异易改变它们的靶模式。2.构建了‘夏黑’葡萄不同发育时期的花序、花、果实小RNA (sRNA)文库,通过Solexa测序以及miRNA序列的保守性和二级结构的典型性分析,共鉴定了130条保守的Vv-miRNAs和80条潜在的非保守的Vv-miRNAs(包含72条新的Vv-miRNAs和8条已知的非保守的Vv-miRNAs).在80条非保守Vv-miRNAs中,有42条(52.5%)在葡萄不同组织中表达,其中20条仅有葡萄果实中表达的特异性。利用生物信息学方法预测了56新的Vv-miRNAs的130条靶基因。同源基因的功能注解表明,这些靶基因在葡萄花果发育以及对环境胁迫反应的应答过程中可能起着重要作用。3.为了进一步认识Vv-miRNA调控靶基因的作用方式,利用5’-RLM-RACE (RNA ligase-mediated5’rapid amplification of cDNA ends)和3’-PPM-RACE (Poly (A) polymerase-mediated3’rapid amplification of cDNA ends)技术对21条Vv-miRNA的36条潜在的靶基因及作用方式开展鉴定。结果验证了18条Vv-miRNAs的31条靶基因并鉴定了它们之间的裂解作用方式及裂解位点,其中约94.4%的Vv-miRNA介导靶基因的裂解位点在miRNA的5’端第10位碱基。Vv-miRNAs及其靶基因在葡萄8种组织的表达水平之间存在相反的变化趋势,靶基因裂解产物在这些组织的积累模式与相应的Vv-miRNAs的表达模式基本一致.4.为了认识原产中国的重要野生葡萄种山葡萄miRNA的功能特性,并进一步研究不同葡萄种同源miRNA的差异,对山葡萄中的小RNA开展了挖掘。通过Solexa测序共鉴定出126条保守miRNAs和34条非保守miRNAs,发现了72条新的山葡萄特异miRNAs (Va-miRNAs).利用miR-RACE技术验证了40条新的Va-miRNAs的精确序列。通过qRT-PCR检测到随机选择的18条Va-miRNAs在山葡萄7个不同组织的表达。Va-miRNAs在28种植物(包括不同葡萄种群)间具有较高的保守性,但同源miRNAs也存在一定的碱基变异。基于不同葡萄种间的同源miRNA序列比较,在山葡萄上发现了的miRNA SNPs (miR-SNPs)和miRNA长度变异(miR-LDs),其中一些变异可能改变其靶模式。利用生物信息学方法预测了新的Va-miRNAs的346条靶基因。同源基因功能注解表明,它们主要涉及抗逆过程(抗寒性、抗病型、抗旱性等)、花青素合成及糖代谢等过程。5.为了从全基因组水平全面认识miRNA在葡萄发育过程中作用模式的时空特性,利用Solexa, Degradome测序及生物信息学方法系统研究了不同发育时期的葡萄叶、花、果组织中Vv-miRNA与靶基因的特性及Vv-miRNA调控靶基因作用模式的时空变化。共鉴定了242条已知的和132条新的miRNA,并验证到193条靶基因,其中103条是已知Vv-miRNA的靶基因,另90条为新Vv-miRNA的靶基因。研究发现,超过50%的新Vv-miRNA在葡萄花、果组织中特异地表达,并在相应组织对其靶基因有特异性地裂解作用,其中花组织中的靶裂解位点具有广泛性。qRT-PCR表达分析发现6条果实的新Vv-miRNA对外源赤霉素(GA)和乙烯处理显著地响应,表明它们参与了与GA和乙烯信号途径相关的葡萄果实发育过程。另一方面,约93.6%的已知miRNA在葡萄发育过程中通过不同作用模式动态调控相应的靶基因,其中不仅存在多个家族的不同成员共同调控靶基因的模式,而且存在miRNA家族的多个成员中只有一个成员在葡萄发育过程中对靶基因起主要调控作用的模式。本研究较大地丰富了葡萄基因组学研究内容,并为葡萄功能基因组学和葡萄花、果发育的机理研究奠定了重要研究基础。

全文目录


摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
縮略词表  15-17
第一章 文献综述  17-41
  1 miRNA的发现及其特征  17-21
    1.1 miRNA的发现  17-19
    1.2 miRNA的分子特征  19-21
  2 miRNA的生物合成  21-25
    2.1 miRNA前体的转录  21-22
    2.2 miRNA的加工运输  22-24
    2.3 miRNA成熟体形成及RISC组装  24-25
  3 miRNA的作用机制  25-27
  4 miRNA的分类  27-28
  5 植物miRNA的生物学功能  28-32
    5.1 miRNA调控植物的形态建成及发育进程  28-29
    5.2 miRNA调控植物对生物与非生物胁迫的应答  29-30
    5.3 miRNA与植物激素的调节及信号转导  30-31
    5.4 miRNA参与自身代谢的反馈调节  31
    5.5 miRNA参与ta-siRNAs的形成  31-32
  6 miRNA的研究方法  32-38
    6.1 miRNA分离和鉴定的方法  32-35
    6.2 miRNA的表达的检测方法  35-38
    6.3 miRNA作用靶基因方式的研究方法  38
  7 果树miRNAs的研究概况  38-40
  8 本研究的目的和意义  40-41
第二章 生物信息学预测的microRNA在鲜食葡萄(hybrids of V.vinifera and V.labrusca)中的精确序列的识别与鉴定  41-71
  摘要  41
  ABSTRACT  41-43
  1 材料与方法  43-51
    1.1 材料  43-44
    1.2 方法  44-51
  2 结果与分析  51-67
    2.1 欧美杂种的鲜食葡萄miRNA的精确序列验证  51
    2.2 同源Vv-miRNAs序列保守性比较  51-53
    2.3 葡萄miRNAs的靶基因预测  53-54
    2.4 葡萄与其它植物中具有碱基差异的同源miRNAs的靶模式比较  54-62
    2.5 葡萄miRNAs的qRT-PCR表达图谱  62-63
    2.6 葡萄miRNAs靶基因的qRT-PCR表达图谱  63-67
  3 讨论  67-71
    3.1 生物信息学预测的Vv-miRNAs的精确序列验证  67-68
    3.2 生物信息学预测与实验验证的miRNAs的一致性比较分析  68
    3.3 葡萄miRNAs的靶基因  68-71
第三章 葡萄花和果实小RNA文库中新microRNA的挖掘与miRBase中葡萄microRNA的验证  71-93
  摘要  71
  ABSTRACT  71-73
  1 材料与方法  73-77
    1.1 实验材料  73
    1.2 小RNA的提取  73-74
    1.3 小RNA的cDNA文库的构建和测序  74
    1.4 生物信息学分析  74-75
    1.5 葡萄的靶基因预测  75
    1.6 利用poly(A)-tailed RT-PCR检测葡萄miRNAs的表达  75-77
  2 结果与分析  77-88
    2.1 葡萄小分子RNA的测序分析  77-80
    2.2 葡萄中保守的miRNA的鉴定  80-82
    2.3 高通量测序的Vv-miRNAs与miRBase中的同源miRNAs保守性比较  82-84
    2.4 葡萄中非保守的miRNA的鉴定  84-85
    2.5 葡萄非保守miRNA的靶基因的预测  85-86
    2.6 葡萄新miRNA的Poly(A)-tailed RT-PCR表达图谱  86-88
  3 讨论  88-93
    3.1 葡萄小分子RNA的高通量测序  88-89
    3.2 葡萄保守miRNA的鉴定  89-90
    3.3 葡萄中保守的miRNA与miRBase中同源序列的一致性分析  90
    3.4 葡萄中非保守的潜在的miRNA的鉴定  90-91
    3.5 葡萄miRNA的靶基因  91-93
第四章 葡萄microRNAs的靶基因的鉴定及作用方式的分析  93-131
  摘要  93
  ABSTRACT  93-96
  1 材料与方法  96-106
    1.1 实验材料  96-101
    1.2 实验方法  101-106
  2 结果与分析  106-128
    2.1 葡萄miRNA的表达谱分析  106-109
    2.2 葡萄miRNA靶基因的表达图谱  109-113
    2.3 葡萄miRNA：mRNA表达水平的相关性  113-116
    2.4 葡萄miRNAs的靶基因的鉴定  116-128
  3 讨论  128-131
    3.1 miRNA的靶基因验证方法  128-129
    3.2 Vv-miRNA家族不同成员的功能保守性  129
    3.3 Vv-miRNA的靶基因及其裂解作用  129-131
第五章 山葡萄新microRNA的识别、鉴定与microRNA保守性的生物信息学分析  131-161
  摘要  131
  ABSTRACT  131-133
  1 材料与方法  133-136
    1.1 实验材料  133-134
    1.2 小分子RNA的提取  134
    1.3 小RNA cDNA文库的构建和测序  134-135
    1.4 生物信息学分析  135
    1.5 miR-5'RACE和miR-3’RACE扩增  135-136
    1.6 葡萄的靶基因预测  136
    1.7 新的Va-miRNAs的荧光定量PCR表达图谱  136
  2 结果与分析  136-157
    2.1 山葡萄小分子RNA的测序分析  136-137
    2.2 山葡萄保守miRNA的鉴定  137-141
    2.3 山葡萄非保守miRNA的鉴定  141-142
    2.4 山葡萄miRNA的精确序列验证  142-143
    2.5 山葡萄miRNA的保守性  143-146
    2.6 高通量测序数据中山葡萄miRNA的SNP分析  146-153
    2.7 山葡萄miRNA的表达图谱分析  153-155
    2.8 山葡萄miRNA的靶基因的预测  155-156
    2.9 利用5'-RLM-RACE验证山葡萄miRNA的靶基因  156-157
  3 讨论  157-161
    3.1 Va-miRNA在不同物种中的序列保守性  158
    3.2 Va-miRNA的靶基因预测及其功能保守性  158-161
第六章 葡萄microRNA调控靶基因作用模式在葡萄发育过程中的动态变化研究  161-197
  摘要  161
  ABSTRACT  161-164
  1 材料与方法  164-165
    1.1 实验材料  164-165
    1.2 小RNA的分离提取  165
    1.3 小RNA cDNA文库的构建和测序  165
    1.4 降解组cDNA文库的构建和测序  165
    1.5 小RNA cDNA文库生物信息学分析  165
    1.6 降解组cDNA文库生物信息学分析  165
  2 结果与分析  165-192
    2.1 不同组织的葡萄sRNA文库中sRNA群体的变化  165-168
    2.2 葡萄发育过程中总的miRNA的丰度变化  168
    2.3 不同葡萄组织中的已知miRNA  168-174
    2.4 不同葡萄组织中的新miRNA  174-178
    2.5 不同组织葡萄的miRNA靶基因  178-185
    2.6 葡萄发育过程中miRNAs调控模式与影响这些模式的因素  185-192
  3 讨论  192-197
    3.1 不同葡萄组织的sRNA文库的时空特性  192-193
    3.2 组织或发育时期特异性的Vv-miRNA  193
    3.3 miRNA裂解靶基因的时空特异性  193-194
    3.4 葡萄发育过程中miRNA裂解靶位点的特异性  194-197
全文结论  197-199
主要创新点  199-201
参考文献  201-215
附表  215-329
读博期间论文发表情况  329-331
致谢  331

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 浆果类 > 葡萄
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