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苹果茎沟病毒的全基因组测序及其侵染性克隆载体的构建

作　者: 赵磊
导　师: 吴云锋
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 苹果 茎沟茎沟病毒 基因组 侵染性克隆
分类号: S436.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


苹果是全世界种植最广泛的重要水果之一。中国无论在苹果种植面积还是产量方面都是世界第一。陕西省是中国的苹果大省，种植面积约600000公顷，产量约占全世界的12%。然而，苹果病毒病的发生却严重影响着苹果的产量和质量。在中国，侵染苹果的主要病毒有苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）、苹果茎痘病毒（Applestem pitting virus, ASPV）和苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）。其中苹果茎沟病毒属于发形病毒属，在全世界范围内发生。本研究于2011-2012年，建立了一种快速、灵敏的检测苹果茎沟病毒的方法，并扩增得到了苹果茎沟病毒的全基因组序列（ASGV-SHX）,其全长为6495bp。基于其全基因组序列以及其外壳蛋白基因的序列以及其它已报道的苹果茎沟病毒序列构建了其系统进化树，分析了其遗传多样性。据我们所知，这是在中国首次报道苹果茎沟病毒的全基因组序列。研究发现，苹果茎沟病毒的基因组RNA包含两个开放阅读框：ORF（16.3kb）和ORF2（1kb），分别编码241和36kDa的蛋白。ORF1编码一个多聚蛋白，ORF2编码运动蛋白和蛋白酶基因。苹果茎沟病毒中国分离物的全基因组核苷酸序列与GeneBank已报道的苹果茎沟病毒序列比对发现，ASGV-SHX与日本已报道的登录号为NC0011749的序列同源率最高为86%。外壳蛋白基因与登录号为D16681和AB004063的序列同源率最高为93%。外壳蛋白基因是苹果茎沟病毒最保守的基因。外壳蛋白的系统进化分析发现，全世界的苹果茎沟病毒分为三个组，每一个组都含有中国的分离物。其中第一组分离物的寄主全部是苹果，主要来自中国、日本、印度、巴西以及韩国。第二组分离物全部来自中国。第三组大部分来自中国，还有美国。各分离物无明显的地理差异，而有一定的寄主差异。为了进一步了解该病毒，本研究构建了其侵染性克隆载体。然后利用农杆菌介导的方法侵染4周龄左右的昆诺藜。对昆诺藜叶片检测结果发现，接种叶片可以检测到该病毒，而接种叶上部的叶片则检测不到。这表明，所构建的侵染性克隆载体可以在昆诺藜内完成转录的过程，而不能表达蛋白。这可能是由于载体5’端没有帽子结构，导致转录的RNA易降解，不能翻译蛋白所致。下一步我们可以将ASGV的全基因组构建到T7启动子载体上，然后利用体外转录的方法，在5’端加上帽子类似物，然后转录昆诺藜，来验证其是否有活性。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章 文献综述  11-14
  1.1 引言  11
  1.2 苹果茎沟病毒病研究现状  11-12
  1.3 本研究的目的及意义  12-14
第二章 材料与方法  14-21
  2.1 材料  14
    2.1.1 植物材料  14
    2.1.2 菌种和质粒等材料  14
    2.1.3 酶和试剂  14
  2.2 方法  14-21
    2.2.1 植物总 RNA 提取方法  14-15
    2.2.2 环介导等温扩增方法  15
    2.2.3 逆转录方法  15
    2.2.4 PCR 扩增方法  15-16
    2.2.5 割胶纯化方法  16
    2.2.6 连接与转化方法  16
    2.2.7 质粒提取方法  16-17
    2.2.8 5’与 3’Race 方法  17-19
    2.2.9 酶切方法  19
    2.2.10 感受态细胞制备方法  19
    2.2.11 农杆菌接种方法  19-21
第三章 反转录环介导等温扩增  21-26
  3.1 引物设计  21
  3.2 RNA 提取与扩增  21-22
  3.3 体系优化  22
  3.4 LAMP 的特异性与灵敏度分析  22-25
  3.5 田间样品的检测  25
  3.6 结果与分析  25-26
第四章 基因组扩增  26-32
  4.1 引物设计  26-27
  4.2 RNA 提取与扩增  27
  4.3 产物纯化与连接转化  27
  4.4 序列测定  27
  4.5 序列拼接  27-28
  4.6 结果与分析  28-31
    4.6.1 基因组全长分析  28-29
    4.6.2 CP 基因分析  29-31
  4.7 讨论  31-32
第五章 侵染性克隆载体构建  32-37
  5.1 载体的选择  32
  5.2 基因片段拼接  32
  5.3 片段与载体连接  32-34
    5.3.1 酶切位点引物设计  32-33
    5.3.2 基因克隆  33
    5.3.3 酶切及产物的纯化  33
    5.3.4 T4 连接、转化及质粒提取  33-34
  5.4 质粒转化农杆菌  34
  5.5 农杆菌接种昆诺藜  34
  5.6 昆诺藜的培养与检测  34-35
  5.7 结果与分析  35
    5.7.1 昆诺藜的分子检测结果  35
    5.7.2 昆诺藜的血清学检测结果  35
  5.8 讨论  35-37
第六章 结论  37-39
  6.1 结论  37-39
参考文献  39-42
附录 A：ASGV 中国分离物核苷酸序列  42-48
致谢  48-49
作者简介  49
硕士期间发表论文与获奖情况  49

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 仁果类病虫害 > 苹果病虫害
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