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荔枝霜疫霉菌生物学特性及其遗传转化体系的建立

作　者: 林娜
导　师: 胡方平; 蔡学清
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 荔枝霜疫霉菌生物学特性原生质体遗传转化 GFP基因
分类号: S436.67
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本文对荔枝霜疫霉菌的生物学特性及其原生质体遗传转化体系进行了较为系统地探讨。研究表明,荔枝霜疫霉菌的孢囊梗属于多级有限生长,其孢子囊可以萌发成芽管、游动孢子和次生孢子囊,该菌培养35d后可产生内生厚垣孢子;同时明确了荔枝霜疫霉菌生长及产孢的最佳条件,菌丝生长最适的条件为:pH 7.0的利马豆培养基,温度为24℃,光照20 h;产孢最适条件为:pH 7.0的PDA培养基,温度为24℃,光照16 h;另外还明确了该菌孢子囊的致死温度为:55℃、10min。当霜疫霉菌在菌龄为11d,温度为24℃,pH值为7时产生的孢子囊萌发率最高。实验还表明,荔枝霜疫霉菌在不同的温度条件、培养时间、pH值和营养成分下其萌发状态和萌发率不同。本研究优化了霜疫霉菌原生质体制备与再生条件,明确了该菌原生质体形成与再生的最佳条件为:PDA培养基,酶为15mg·mL-1崩溃酶,酶解时间为4h,酶解温度为30℃,菌龄为4d,再生培养基是以0.6M甘露醇为渗透压稳定剂的利马豆培养基。最终得到原生质体产量为107个·mL-1,再生率为0.1%。本研究还建立了荔枝霜疫霉菌的原生质体遗传转化体系,构建了1个GFP表达载体。并成功地将pHAMT35G-gfp表达载体和pTH209选择标记质粒转化到霜疫霉菌原生质体中,得到转化子。经过选择性平板筛选、PCR扩增目的片段验证,确认nptⅡ和GFP基因己经插入霜疫霉菌基因组中。

全文目录

摘要  10-11
Abstract  11-12
1 前言  12-20
  1.1 荔枝霜疫霉菌研究概况  12-13
    1.1.1 荔枝霜疫霉菌简介  12
    1.1.2 荔枝霜疫霉菌的致病机理研究概况  12
    1.1.3 荔枝霜疫霉菌防治措施  12-13
  1.2 真菌原生质体的研究概况  13-18
    1.2.1 原生质体制备  14-15
    1.2.2 原生质体再生  15
    1.2.3 原生质体转化  15-18
      1.2.3.1 PEG-CaCl_2 介导的真菌遗传转化  15-16
      1.2.3.2 电激转化系统  16
      1.2.3.3 限制性内切酶介导的真菌遗传转化  16-17
      1.2.3.4 用于原生质体转化的选择标记  17-18
  1.3 GFP 基因在真菌中的应用  18-19
  1.4 本研究的目的和意义  19-20
2 荔枝霜疫霉菌的生物学特性  20-33
  2.1 材料与方法  20-23
    2.1.1 供试菌株  20
    2.1.2 供试培养基  20
    2.1.3 霜疫霉菌形态特征  20
    2.1.4 荔枝霜疫霉菌生长及产孢条件研究  20-21
      2.1.4.1 不同培养基对荔枝霜疫霉菌生长及产孢的影响  20-21
      2.1.4.2 不同光照条件对荔枝霜疫霉菌生长及产孢的影响  21
      2.1.4.3 不同温度对荔枝霜疫霉菌生长及产孢的影响  21
      2.1.4.4 不同pH 值对荔枝霜疫霉菌生长及产孢的影响  21
      2.1.4.5 荔枝霜疫霉菌孢子致死温度的测定  21
    2.1.5 荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的条件测定  21-22
      2.1.5.1 不同培养基对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的影响  21
      2.1.5.2 不同温度对霜疫霉菌孢子囊萌发的影响  21-22
      2.1.5.3 不同pH 值的培养基上所产生的孢子囊对其萌发的影响  22
      2.1.5.4 不同培养时间对霜疫霉菌孢子囊萌发的影响  22
      2.1.5.5 不同营养成分对霜疫霉菌孢子囊萌发的影响  22
    2.1.6 荔枝霜疫霉菌侵染条件的测定  22-23
      2.1.6.1 不同温度对荔枝霜疫霉菌侵染荔枝的影响  22
      2.1.6.2 霜疫霉菌对不同成熟度荔枝的侵染情况  22-23
  2.2 结果和分析  23-31
    2.2.1 霜疫霉菌形态学特征  23-24
    2.2.2 荔枝霜疫霉菌生长及产孢条件研究  24-27
      2.2.2.1 不同培养基对荔枝霜疫霉菌生长及产孢的影响  24
      2.2.2.2 不同温度对荔枝霜疫霉菌生长及产孢的影响  24-25
      2.2.2.3 不同光照条件对荔枝霜疫霉菌生长及产孢的影响  25-26
      2.2.2.4 不同pH 值对荔枝霜疫霉菌生长及产孢的影响  26-27
      2.2.2.5 荔枝霜疫霉菌致死温度的测定  27
    2.2.3 环境因子对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的影响  27-30
      2.2.3.1 不同光照条件对霜疫霉菌孢子囊萌发的影响  27
      2.2.3.2 不同培养时间对霜疫霉菌孢子囊萌发的影响  27
      2.2.3.3 不同温度对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的影响  27-29
      2.2.3.4 不同pH 值的培养基上产生的孢子囊对其萌发的影响  29-30
      2.2.3.5 不同营养成分对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的影响  30
    2.2.4 不同条件对荔枝霜疫霉菌侵染荔枝的影响  30-31
      2.2.4.1 不同温度对霜疫霉菌侵染荔枝的影响  30
      2.2.4.2 霜疫霉菌对不同成熟度荔枝的侵染情况  30-31
  2.3 小结和讨论  31-33
3 荔枝霜疫霉菌遗传转化体系的建立  33-54
  3.1 材料  33-35
    3.1.1 菌株和质粒  33
    3.1.2 主要试剂  33-34
    3.1.3 培养基  34-35
    3.1.4 试剂盒  35
    3.1.5 酶  35
  3.2 荔枝霜疫霉菌的培养  35
  3.3 荔枝霜疫霉菌原生质体制备  35-36
    3.3.1 酶系组成对原生质体产量的影响  35-36
    3.3.2 崩溃酶浓度对原生质体产量的影响  36
    3.3.3 酶反应时间对原生质体产量的影响  36
    3.3.4 不同酶解温度对原生质体产量的影响  36
    3.3.5 不同培养基所产生的菌丝对其原生质体产量的影响  36
    3.3.6 不同菌龄对原生质体产量的影响  36
  3.4 荔枝霜疫霉菌原生质体再生  36-37
    3.4.1 酶反应时间对原生质体再生的影响  37
    3.4.2 不同菌龄对原生质体再生的影响  37
    3.4.3 不同再生培养基对原生质体再生的影响  37
    3.4.4 渗透压稳定剂的种类和浓度对原生质体再生的影响  37
    3.4.5 原生质体再生菌株的生长性状  37
  3.5 荔枝霜疫霉菌的gfp 基因转化  37-41
    3.5.1 质粒的提取  37-38
    3.5.2 从琼脂糖凝胶中回收DNA  38
    3.5.3 T-gfp 载体构建  38-40
      3.5.3.1 gfp 基因PCR 扩增  38
      3.5.3.2 目的DNA 与载体pMD18 连接  38-39
      3.5.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  39
      3.5.3.4 重组质粒的酶切鉴定  39-40
      3.5.3.5 重组克隆的PCR 快速鉴定  40
      3.5.3.6 DNA 序列测定及分析  40
    3.5.4 pHAMT35G-gfp 载体的构建  40
    3.5.5 荔枝霜疫霉菌对G418 的敏感性测定  40
    3.5.6 荔枝霜疫霉菌原生质体的转化  40-41
    3.5.7 转化子验证  41
      3.5.7.1 选择培养基上的再次筛选  41
      3.5.7.2 荔枝霜疫霉菌转化子DNA 的提取  41
      3.5.7.3 转化子的PCR 验证  41
  3.6 结果与分析  41-51
    3.6.1 荔枝霜疫霉菌原生质体制备  41-45
      3.6.1.1 原生质体的形成和释放过程  41-42
      3.6.1.2 不同酶种类对原生质体产量的影响  42-43
      3.6.1.3 崩溃酶浓度对原生质体产量的影响  43
      3.6.1.4 酶解时间对原生质体产量的影响  43
      3.6.1.5 不同酶解温度对原生质体产量的影响  43-44
      3.6.1.6 不同菌龄对原生质体产量的影响  44
      3.6.1.7 不同营养成分对原生质体产量的影响  44-45
    3.6.2 荔枝霜疫霉菌原生质体再生  45-48
      3.6.2.1 原生质体再生菌株的生物学性状  45
      3.6.2.2 酶反应时间对原生质体再生的影响  45-47
      3.6.2.3 不同菌龄对原生质体再生的影响  47
      3.6.2.4 渗透压稳定剂种类和浓度对原生质体再生的影响  47-48
      3.6.2.5 不同再生培养基对原生质体再生的影响  48
    3.6.3 荔枝霜疫霉菌的gfp 基因转化  48-51
      3.6.3.1 用于转化子筛选的G418 浓度的确定  48
      3.6.3.2 gfp 基因的PCR 扩增  48
      3.6.3.3 重组质粒T-gfp 克隆子PCR 和酶切鉴定  48-49
      3.6.3.4 重组质粒pHTAM35G-gfp 的PCR 和酶切鉴定  49-50
      3.6.3.5 转化子的形态特征  50
      3.6.3.6 pTH209 和pHAMT35G-gfp 共转化野生菌克隆子的PCR 鉴定  50
      3.6.3.7 转化子的荧光检测  50-51
  3.7 小结与讨论  51-54
4 结论与讨论  54-55
  4.1 主要研究结果  54
  4.2 特色  54-55
参考文献  55-58
致谢  58

荔枝霜疫霉菌生物学特性及其遗传转化体系的建立

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