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运用超低温技术脱除梨离体植株潜隐病毒研究

作　者: 唐敏
导　师: 洪霓
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 梨超低温处理茎尖培养病毒脱除
分类号: S436.612.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)是梨树上的3种主要潜隐病毒,在我国梨树上发生普遍,常导致梨树生长势及果品产量和质量下降。目前尚未发现这三种潜隐病毒的自然传播介体,它们主要是通过无性繁殖材料和种苗调运传播。培育无病毒种苗、发展无病毒栽培是防治梨病毒病病害的有效途径。目前应用较广泛的植物病毒脱除方法包括茎尖培养、热处理和化学处理,近些年来,超低温处理已在多种植物病毒的脱除中得到应用,该方法相比传统的热处理和化学处理等方法,具有操作简单、快速和成本低廉等优点。为构建适合我国不同梨种质的病毒脱除技术体系,本研究以带有潜隐病毒的梨离体植株为材料,对超低温处理参数进行了优化,同时对其脱病毒效果进行了评价。1.2010年分别从湖北果茶所、山东烟台农科院和华中农业大学等地采集18个梨样品的枝条,采用RT-PCR方法对ACLSV、ASGV和ASPV进行了检测,结果表明除湖北康佛伦斯样品没有检测到病毒外,其它样品至少带一种潜隐病毒。其中4个样品带有这3种病毒,12个样品带有ASGV和ACLSV或ASGV和ASPV。2.对所收集的梨样品进行了茎尖分离培养,获得了14个品种的离体培养植株。研究发现不同梨品种的茎尖培养成活率存在明显差异,并与各品种所属梨系统有关。其中7个沙梨品种的离体茎尖成活率相对较高,为50%-100%；西洋梨成活率相对较低为0-40%；两个白梨品种成活率分别为57.4%和81.25%；1个秋子梨系统品种南果的成活率为46.67%。3.以沙梨品种真渝离体植株为材料,对影响超低温处理后茎尖存活的三个关键因子-预培养时间、装载时间及玻璃化溶液的处理时间进行了优化,结果表明,玻璃化溶液处理时间对超低温处理后的茎尖成活率影响最大,预培养2d、装载20mmin及玻璃化溶液PVS2处理90～100mmin可有效降低茎尖死亡率。采用该技术体系,对4个沙梨品种离体植株进行超低温处理,对获得再生植株。进行病毒检测的结果表明,超低温处理对不同沙梨品种的病毒脱除效率存在差异,中梨1号脱毒效率最高,达100%,而黄金梨和鄂梨2号的病毒均未能完全脱除。4.根据以上结果,分别将变温热处理38℃/320℃(16h/8h)30d及化学处理(20mg/L病毒醚；30d、40d)与超低温处理结合,分析比较其脱除病毒效果。结果表明,不同品种离体植株在热处理过程中的生长状况与超低温处理后茎尖存活率存在相关性。红贝蕾莎和圆黄离体植株受热处理影响最小,超低温处理后茎尖成活率高达85.0%；而美人酥受热处理影响最大,超低温处理后茎尖成活率最低,仅有40%。不同品种病毒脱除效率也存在差异,其中圆黄的病毒脱除效率最高,为90%,其次为丰水和红贝蕾莎,雪花梨和美人酥的病毒脱除效率最低,仅有20%。不同病毒的脱除效率也存在较大差异,其中ASPV脱除率达100%,ASGV的脱除效率为20%-90%。5.以丰水和美人酥离体植株为材料,采用化学处理(20mg/L病毒醚；30d、40d)与超低温处理结合,分析其脱除病毒效果,结果表明,病毒醚处理过对梨离体植株生长无明显影响,且超低温处理后茎尖成活率较高,可达86.6%。病毒脱除效果与病毒醚处理时间有关,病毒醚处理由30d延长至40d后进行超低温处理,丰水和美人酥的ASGV脱除效率分别由84.6%和60%提高至90%和80%。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
缩略语表  12-13
第一章文献综述  13-26
  1.1 梨树上主要的潜隐病毒种类  13-16
    1.1.1 ASGV的危害特点及分子特性  13-14
    1.1.2 ACLSV的危害特点及分子特性  14-15
    1.1.3 ASPV的危害特点及分子特性  15-16
  1.2 植物病毒的脱毒技术  16-22
    1.2.1 热处理脱毒  16-17
    1.2.2 茎尖培养脱毒  17-18
    1.2.3 热处理结合茎尖培养脱毒  18
    1.2.4 茎尖微芽嫁接脱毒  18-19
    1.2.5 化学处理脱毒  19-20
    1.2.6 超低温脱毒  20-22
  1.3 病毒检测方法  22-24
    1.3.1 生物学鉴定  22-23
    1.3.2 血清学检测  23-24
    1.3.3 分子生物学检测  24
  1.4 研究的目的和意义  24-26
第二章梨离体植株的获得及病毒检测  26-34
  2.1 供试材料  26-27
    2.1.1 样品的来源  26
    2.1.2 MS培养基所需母液  26
    2.1.3 试验试剂  26-27
      2.1.3.1 RNA提取主要试剂  26-27
      2.1.3.2 RT-PCR所用主要试剂  27
  2.2 研究方法  27-29
    2.2.1 RT-PCR检测  27-29
      2.2.1.1 总RNA提取  27
      2.2.1.2 RT-PCR所用引物  27-28
      2.2.1.3 反转录合成cDNA第一链  28
      2.2.1.4 PCR扩增  28-29
    2.2.2 茎尖剥离与培养  29
  2.3 结果与分析  29-32
    2.3.1 田间采集样品的带毒检测  29-30
    2.3.2 从田间采集的不同品种梨茎尖诱导分化情况  30-32
  2.4 小结与讨论  32-34
第三章超低温体系的优化及脱毒效果研究  34-44
  3.1 供试材料  34
  3.2 研究方法  34-36
    3.2.1 玻璃化超低温处理步骤  34-35
    3.2.2 玻璃化超低温体系的优化  35-36
    3.2.3 病毒检测  36
  3.3 结果与分析  36-44
    3.3.1 梨超低温体系优化  36-40
      3.3.1.1 正交试验结果分析  36-38
      3.3.1.2 预培养条件对超低温处理后茎尖成活率的影响  38
      3.3.1.3 PVS2溶液处理时间对超低温处理后茎尖成活率的影响  38-39
      3.3.1.4 超低温处理后茎尖的形态发生和植株再生  39
      3.3.1.5 超低温处理体系优化结果  39-40
    3.3.2 玻璃化法超低温法处理离体植株的病毒脱除效果  40-42
      3.3.2.1 超低温处理不同步骤对梨茎尖再生及脱毒效果的影响  40
      3.3.2.2 不同品种梨茎尖在超低温处理后茎尖再生及脱毒效果  40-41
      3.3.2.3 不同品种梨茎尖超低温处理后脱毒效果的比较  41-42
    3.3.3 小结与讨论  42-44
第四章超低温处理与热处理、化学处理相结合的脱毒效果研究  44-55
  4.1 供试材料  44
  4.2 研究方法  44-46
    4.2.1 超低温处理结合化学处理  44-46
      4.2.1.1 病毒醚的配制  44
      4.2.1.2 预培养方法  44-45
      4.2.1.3 超低温处理结合化学处理试验  45-46
    4.2.2 超低温处理结合变温热处理  46
    4.2.3 病毒检测  46
  4.3 结果与分析  46-53
    4.3.1 超低温结合化学处理  46-48
      4.3.1.1 20μg/mL病毒醚处理对“丰水”和“美人酥”梨离体植株生长的影响  46-47
      4.3.1.2 预培养时间的筛选  47-48
    4.3.2 超低温处理结合变温热处理试验  48-51
      4.3.2.1 变温热处理对不同品种梨离体植株生长情况的影响  48-50
      4.3.2.2 超低温处理结合变温热处理对梨茎尖存活率的影响  50-51
    4.3.3 玻璃化超低温脱毒效果  51-53
      4.3.3.1 超低温处理结合变温热处理后不同品种梨植株脱毒效果  51
      4.3.3.2 超低温处理结合化学处理后不同梨品种脱毒情况  51-53
  4.4 总结与讨论  53-55
参考文献  55-64
附录主要溶液及试剂的配置  64-66
致谢  66

运用超低温技术脱除梨离体植株潜隐病毒研究

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