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喜树碱对甜菜夜蛾Top I的影响

作　者: 马德君
导　师: 李传仁; 蒋红云
学　校: 长江大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: DNA拓扑异构酶Ⅰ 喜树碱甜菜夜蛾 IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞植物源农药
分类号: S433.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 53次
引　用: 1次
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内容摘要

拓扑异构酶I (Top Ⅰ)是一种在生物体内参与细胞内DNA复制、转录、修复和重组等关键过程的酶类之一,其主要通过DNA链剪切与再连接循环机制解决DNA扭转张力问题。自1988年证实真核生物Top I是喜树碱及其衍生物的唯一作用靶标以来,大量研究也揭示喜树碱及其衍生物主要通过稳定结合于DNA复制与转录过程中暂时形成的Top I-DNA可裂解复合物(Top Icc)来实现对细胞生长的抑制作用。本研究在开展前发现0.1-30μM喜树碱处理后的甜菜夜蛾中肠脂肪体细胞(IOZCAS-Spex-II)生长停止,并伴随细胞凋亡特征出现,同时还发现可能由Top Icc引发的DNA链断裂现象。鉴于喜树碱对昆虫和癌细胞的毒理特征类似,本文探讨了喜树碱发展成为植物源农药先导化合物的可能性,首先测定了喜树碱和羟基喜树碱对细胞粗酶液中甜菜夜蛾Top I酶解螺旋活性的影响,然后进行甜菜夜蛾Top I基因克隆与Top I蛋白质原核表达纯化,继而测定了喜树碱和羟基喜树碱对纯化Top I酶解螺旋活性的影响,并通过荧光定量PCR测定了喜树碱和羟基喜树碱对细胞内Top I基因表达水平的影响,最后测定了喜树碱和羟基喜树碱处理后细胞内甜菜夜蛾Top I酶活性的动态变化,旨在从基因水平、转录水平和酶活性水平上阐明喜树碱对甜菜夜蛾Top I靶标的作用方式和机制,从而揭示喜树碱对昆虫生长抑制和致死作用的分子毒理机制,主要结论如下：通过联合反转录PCR (RT-PCR)和cDNA末端快速扩增法(RACE)分别扩增甜菜夜蛾Top I基因核心序列(1626bp)及其两末端序列。Top I cDNA全长序列为3743bp,其中5’UTR(非编码区)和3’UTR(非编码区)分别80bp和870bp,编码区中开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)长度为2793bp,编码930个氨基酸,以UAA为终止密码子。Clustalx软件多重比对结果表明,甜菜夜蛾Top I氨基酸序列与11个物种同源性均超过42.58%,并与家蚕Top I氨基酸序列同源性达到65.25%。以MEGA5.0构建的进化树显示,甜菜夜蛾Top I与喜树TopI间遗传进化距离较远,从而揭示出氨基酸多态性的存在与喜树碱敏感性或抗性发生相关。相比喜树Top Ⅰ,甜菜夜蛾Top Ⅰ蛋白质中喜树碱结合位点如E418,Q421,L617,R621,A653,E710,N722,S729(根据人Top I氨基酸序列编号)没有发生突变,从分子进化水平上表明甜菜夜蛾Top I是天然的喜树碱敏感蛋白质。为证实甜菜夜蛾Top Ⅰ是否具有喜树碱敏感特性,本研究建立Top I酶反应外体系,通过超螺旋DNA解旋法测定喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-II细胞粗酶液Top I和纯酶TOP70酶解螺旋活性的抑制影响。TOP70是去除N端335个氨基酸的非完整性Top I蛋白质,通过构建PGEX-TOP70重组载体,并在大肠杆菌BL21(DE)菌株中诱导表达纯化而得。抑制结果表明,喜树碱及羟基喜树碱对Top I酶解螺旋活性和纯酶TOP70的抑制影响具有浓度依赖性,呈类“S”型动力学曲线变化。当药物浓度在1.00-7.50μM间,喜树碱抑制率显著高于羟基喜树碱抑制率,而在浓度分别为0.01-1.00μM和7.50-100μM时,两药物抑制率无显著差异性。喜树碱及羟基喜树碱对TOP70的抑制率高于药物对细胞粗酶液TopI的抑制率,这表明蛋白纯化可消除未知蛋白对药物抑制率的影响,但不同状态下的酶本质上是不变的,只有量上的差异。细胞内甜菜夜蛾Top Ⅰ蛋白质对喜树碱具有敏感性,同时这种敏感性具有瞬时性和累积性,而不具有浓度依赖性。本研究采用酶液2倍稀释法测定每个药物处理下细胞内Top I酶活性,并作比较分析。结果表明,不同时间点上(0,2,4,6,12,24,48h)对照组细胞内Top Ⅰ酶比活力值间无显著差异(相对比活力值为1)。10.0μM喜树碱和10.0μM羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-II细胞表现出较为一致的时间积累性,随着处理时间的积累,Top Ⅰ酶活性逐渐降低到一个水平。两药物在24h对细胞内Top Ⅰ酶活性抑制率无显著差异,但在48h喜树碱对细胞内Top Ⅰ酶活性的抑制率显著高于羟基喜树碱,可检测到该时间点的细胞内Top I不能解旋DNA。同时,喜树碱和羟基喜树碱对细胞内Top I酶活性的影响没有显著的浓度相关性。除了0.50μM羟基喜树碱没有抑制细胞内Top I酶活性外,其余浓度梯度下的喜树碱和羟基喜树碱都能显著降低细胞内Top I酶活性(0.10,0.50,1.00,5.00,10.0,50.0,100μM),浓度间Top I酶比活力值无显著差异性。细胞内甜菜夜蛾Top I mRNA表达量对喜树碱敏感性降低,而这种敏感性具有时间累积性,不呈浓度依赖性。通过荧光定量PCR测定每个药物处理组和对照组中Top I mRNA表达量,并用2-△△Ct方法进行浓度间和不同时间点间的比较分析。结果表明,在不同时间点上(0,2,4,6,12,24,48h)对照组细胞内TopI mRNA表达量间无显著差异(相对基因表达为1)。在12,24和48h,检测到10.0μM喜树碱和10.0μM羟基喜树碱处理后的IOZCAS-Spex-II细胞内Top ImRNA表达量都上调增加。但在48h,喜树碱处理细胞内Top I mRNA表达量仍然高于羟基喜树碱处理细胞内Top I mRNA表达量。除了50.0和100μM羟基喜树碱外,其余各浓度下喜树碱和羟基喜树碱处理后细胞内Top I mRNA表达量都能上调增加(0.10,0.50,1.00,5.00,10.0,50.0,100μM),浓度间Top I mRNA表达量无显著差异性。综上所述,喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-II细胞内Top I的作用是多水平交叉的,从而实现对细胞生长的抑制并诱导细胞死亡。基于Top I基因序列与细胞药物反应的分析,证实喜树碱对甜菜夜蛾Top I的多水平影响建立在转录水平上而不是在复制水平上。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
第1章绪论  14-29
  1.1 植物源农药生物合理性  14-15
    1.1.1 植物源农药种类与功能  14
    1.1.2 植物源农药作用机制  14-15
  1.2 喜树碱-植物源农药新推物  15-19
    1.2.1 喜树碱发现与医药应用  15-16
    1.2.2 喜树碱成为植物源农药的可能性  16-17
    1.2.3 喜树碱及衍生物结构功效  17-19
  1.3 喜树碱作用靶标-DNA拓扑异构酶Ⅰ  19-23
    1.3.1 拓扑异构酶Ⅰ分类与生物功能  19-20
    1.3.2 拓扑异构酶Ⅰ催化机制  20
    1.3.3 喜树碱作用于拓扑异构酶Ⅰ的分子毒理机制  20-21
    1.3.4 拓扑异构酶Ⅰ蛋白质一级结构与喜树碱敏感性或抗性发生  21-23
  1.4 TopⅠcc的分子细胞毒理学机制  23-25
    1.4.1 TopⅠcc是细胞DNA损伤修复与凋亡信号的起始点  23-24
    1.4.2 TopⅠcc存在下细胞对Top Ⅰ的调控  24-25
  1.5 拓扑异构酶Ⅰ抑制剂概况  25
  1.6 昆虫拓扑异构酶Ⅰ功能研究进展  25-26
  1.7 研究思路  26-29
    1.7.1 研究背景  26-27
    1.7.2 研究目的与研究意义  27
    1.7.3 研究内容  27-29
第2章喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞粗酶液Top Ⅰ酶活性的体外抑制测定  29-36
  2.1 材料方法  29-32
    2.1.1 细胞培养  29
    2.1.2 供试药物  29
    2.1.3 化学试剂  29-30
    2.1.4 试剂配制  30
    2.1.5 试验仪器  30
    2.1.6 试验步骤  30-32
  2.2 结果与分析  32-35
    2.2.1 甜菜夜蛾Top Ⅰ酶解螺旋活性的测定  32
    2.2.2 喜树碱和羟基喜树碱抑制Top Ⅰ酶解螺旋活性  32-35
  2.3 结论与讨论  35-36
第3章甜菜夜蛾Top Ⅰ基因克隆  36-55
  3.1 材料与方法  36-45
    3.1.1 细胞培养  36
    3.1.2 化学试剂  36-37
    3.1.3 载体与宿主菌  37
    3.1.4 试验仪器  37
    3.1.5 试剂配制  37-38
    3.1.6 试验步骤  38-45
  3.2 结果与分析  45-54
    3.2.1 总RNA提取  45-46
    3.2.2 引物设计与筛选  46
    3.2.3 反转录PCR扩增部分目的片段(RT-PCR)  46-47
    3.2.4 3’RACE和5’RACE扩增Top Ⅰ cDNA两末端序列  47
    3.2.5 Top Ⅰ cDNA全长序列的拼接与ORF序列扩增  47-48
    3.2.6 序列分析  48-54
  3.3 结论与讨论  54-55
第4章甜菜夜蛾Top Ⅰ基因原核表达与蛋白纯化  55-66
  4.1 材料与方法  55-60
    4.1.1 菌种与表达载体  55
    4.1.2 主要化学试剂  55
    4.1.3 主要试验仪器  55
    4.1.4 试剂配制  55-57
    4.1.5 引物设计  57-58
    4.1.6 试验步骤  58-60
  4.2 结果与分析  60-65
    4.2.1 含有BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的目的序列的扩增  60-61
    4.2.2 PGEX-TOP70和PGEX-TOP Ⅰ重组载体的双酶切鉴定  61
    4.2.3 重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图谱  61-63
    4.2.4 重组蛋白的纯化分离  63
    4.2.5 TOP70酶活性与比活力测定  63-65
  4.3 结论与讨论  65-66
第5章喜树碱和羟基喜树碱对纯TOP70酶活性的体外抑制测定  66-72
  5.1 材料与方法  66-67
    5.1.1 供试药物  66
    5.1.2 化学试剂  66
    5.1.3 试剂配制  66
    5.1.4 试验仪器  66-67
    5.1.5 试验步骤  67
  5.2 结果与分析  67-70
    5.2.1 喜树碱和羟基喜树碱抑制TOP70酶解螺旋活性  67-70
  5.3 结论与讨论  70-72
第6章喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞内Top Ⅰ基因表达量的影响  72-81
  6.1 材料与方法  72-74
    6.1.1 细胞培养  72
    6.1.2 供试药物  72
    6.1.3 主要试剂  72-73
    6.1.4 主要仪器  73
    6.1.5 试验步骤  73-74
  6.2 结果与分析  74-79
    6.2.1 引物扩增效率与溶解曲线的测定  74-76
    6.2.2 不同浓度喜树碱和羟基喜树碱对细胞Top Ⅰ mRNA表达量的影响  76-77
    6.2.3 10.0 μM喜树碱和羟基喜树碱处理后细胞不同时刻Top Ⅰ mRNA的变化趋势分析  77-79
  6.3 结论与讨论  79-81
第7章喜树碱和羟基喜树碱对IOZCAS-Spex-Ⅱ细胞内Top Ⅰ酶活性的影响  81-88
  7.1 材料与方法  81-82
    7.1.1 细胞培养  81
    7.1.2 供试药物  81
    7.1.3 化学试剂  81
    7.1.4 试剂配制  81
    7.1.5 试验仪器  81
    7.1.6 试验步骤  81-82
  7.2 结果与分析  82-86
    7.2.1 不同浓度喜树碱和羟基喜树碱对细胞内Top Ⅰ酶活性的影响  82-84
    7.2.2 10.0 μM喜树碱和羟基喜树碱处理后细胞不同时刻Top Ⅰ酶活性的变化  84-86
  7.3 结论与讨论  86-88
第8章总结与展望  88-90
  8.1 总结  88-89
  8.2 展望  89-90
致谢  90-91
参考文献  91-95
个人简介  95-96

喜树碱对甜菜夜蛾Top I的影响

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