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2型猪链球菌GlnA/ECE1双基因缺失株的构建和ECE1单克隆抗体的制备

作　者: 徐海军
导　师: 肖少波
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 2型猪链球菌病内皮素转化酶一单克隆抗体
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype 2, S. suis 2）可以引发人和猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎等,是一种人畜共患病原菌。2型猪链球菌病对猪的危害极大,猪群发病死亡率高。本研究在2型猪链球菌谷氨酰胺合成酶基因△GlnA缺失株的基础上构建了猪链球2型△GlnA/ECEl双基因缺失株,并筛选出了能稳定分泌ECE1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为猪链球菌基因工程弱毒疫苗的研制和猪链球菌病诊断方法的建立提供了参考基础,主要研究内容有：1.2型猪链球△GlnA/ECEl双基因缺失株的筛选将带有ECE1上下游同源臂的重组质粒电转化S. suis SC19△GlnA感受态细胞,经过抗性培养基筛选和PCR的鉴定,最后成功获得S. suis SC19△GlnA/ECE1双基因缺失株。2.2型猪链球△GlnA/ECEl双基因缺失株的生物学特性研究实验选取S. suis SC19、S. suis SC19△GlnA、S. suis SC19△GlnA/ECE1三个菌株同时进行相同条件下的实验。结果显示△GlnA/ECE1双基因缺失菌株在TSA固体培养基上的菌落形态大小没发生变化,在加绵羊血的TSA培养基上的溶血能力也没有变化,并且在TSB培养基中传代能稳定生长。测定三个菌株随时间变化的菌液的吸光度值的变化,并绘制变化曲线,结果显示△GlnA缺失株生长速度变慢,△GlnA/ECE1缺失株与△GlnA缺失株相比没有变化。用国际认定的法国梅里埃API20 Strep标准检测三个菌株的生化特性,结果显示△GlnA/ECE1缺失株和△GlnA缺失株没有差异,只是与野毒株相比其中a-galactosidae检测变为阴性。△GlnA/ECE1缺失株对Hep-2的粘附和毒性能力与△GlnA缺失株对比略有所下降,但是与野毒株相比下降明显。3.2型猪链球△GlnA/ECE1双基因缺失株对CD1小鼠致病力的变化选取S. suis SC19、S. suis SC19△GlnA、S. suis SC19△GlnA/ECE1三个菌株同时进行相同条件下的动物实验。实验结果显示S. suis SC19△GlnA/ECE1双基因缺失株感染CD1小鼠的LD50明显高于两个亲本株,其感染所致的发病率和死亡率与两个亲本株相比也下降很多。感染后的小鼠不同组织随时间变化的带菌量曲线图显不,△GlnA/ECE1双基因缺失株感染组小鼠的组织带菌量比野毒株感染组明显下降很多,与△GlnA基因缺失株感染组相比略有降低。△GlnA/ECE1突变株感染组小鼠脑和肺组织切片在显微镜下观察都正常,基本没有可视病理损伤；而△GlnA基因敲除突变株感染组脑组织基本无可观病理变化,但肺组织有炎性细胞渗出病变；野毒株感染组的小鼠脑和肺组织均发生了严重的病理变化。4.内皮素转化酶1在大肠杆菌系统中的高效表达根据GenBank上SSU05₀153的基因序列设计PCR扩增内皮素转化酶1的全长基因序列的引物,成功构建了表达载体pET-28a ECE1,然后转化大肠杆菌BL21,经过酶切鉴定正确后保存备用。实验通过不同的条件下的摸索,最终确定在37℃摇床上IPTG （0.4mmol/mL）诱导表达4小时为ECE1表达条件,并确定可溶性表达产物与包涵体蛋白都有产生,为了纯化方便实验进行纯化可溶性表达的蛋白。5.内皮素转化酶1单克隆抗体的制备将诱导表达后纯化的ECE1蛋白作为抗原免疫Babl/c小鼠制备免疫脾细胞,用细胞融合技术与SP2/0骨髓瘤细胞融合。以ECE1蛋白为包被抗原用间接ELISA的方法筛选融合后的阳性细胞株,用有限稀释的方法克隆三次后最终获得六株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。分别以SC19株菌体和△GlnA/ECE1突变株菌体为抗原,制备的小鼠腹水单抗为一抗分别进行western blot验证实验,结果显示有两株单抗细胞株与SC19株反应为阳性,命名为SE3和SE6。所有细胞株单抗与△GlnA/ECEl突变株反应为阴性。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩写词  10-12
第1章文献综述  12-21
  1.1 2型猪链球菌病  13-19
    1.1.1 历史概况  13
    1.1.2 病原学  13
    1.1.3 流行病学  13-14
    1.1.4 致病机理  14-15
    1.1.5 临床症状和病理变化  15-16
    1.1.6 诊断  16
    1.1.7 防制  16-17
    1.1.8 主要毒力因子  17-19
  1.2 疫苗的研究进展  19-21
    1.2.1 灭活疫苗  19
    1.2.2 活菌疫苗  19
    1.2.3 基因工程疫苗  19-21
第2章研究的目的和意义  21-22
第3章 2型猪链球菌GlnA/ECE1双基因缺失株的构建  22-40
  3.1 实验材料  22-24
    3.1.1 所用的菌株、质粒和细胞  22
    3.1.2 所用培养基与抗生素及其配方  22
    3.1.3 所用缓冲液及其配方  22-23
    3.1.4 试剂盒和主要试剂  23
    3.1.5 引物  23
    3.1.6 实验动物  23-24
  3.2 实验方法  24-28
    3.2.1 菌种的复苏  24
    3.2.2 质粒的中量提取(试剂盒)  24
    3.2.3 目的质粒电转入S.suis SC19△GlnA  24-25
    3.2.4 基本生物学特性研究  25-26
    3.2.5 细胞感染实验  26-27
    3.2.6 CD1小鼠的感染实验  27-28
  3.3 实验结果与分析  28-37
    3.3.1 双基因缺失株的鉴定  28-29
    3.3.2 双基因缺失株基本生物学特性的研究  29-32
    3.3.3 细胞感染实验  32-34
    3.3.4 CD1小鼠感染实验  34-37
  3.4 讨论  37-40
    3.4.1 GlnA/ECE1双基因的选择  37-38
    3.4.2 GlnA/ECE1双基因缺失株的筛选  38
    3.4.3 GlnA/ECE1双基因缺失株的致病力变化  38-40
第4章 2型猪链球菌ECE1单克隆抗体的制备  40-56
  4.1 实验材料  40-42
    4.1.1 所用质粒和细胞  40-41
    4.1.2 主要试剂  41
    4.1.3 缓冲液和试剂配方  41-42
    4.1.4 引物序列  42
    4.1.5 实验动物  42
  4.2 实验方法  42-51
    4.2.1 2型猪链球菌SC19基因组的提取  42-43
    4.2.2 ECE1重组表达质粒的构建  43-46
    4.2.3 内皮素转化酶1的表达和纯化  46-47
    4.2.4 细胞融合与阳性克隆株的筛选  47-50
    4.2.5 小鼠腹水抗体的制备  50-51
    4.2.6 Western blot验证试验  51
  4.3 实验结果与分析  51-55
    4.3.1 ECE1全长序列的扩增  51-52
    4.3.2 克隆载体和表达载体的构建  52
    4.3.3 ECE1表达条件的确定  52-53
    4.3.4 间接ELISA中ECE1最佳包被浓度的确定  53-54
    4.3.5 杂交瘤细胞的制备和筛选  54
    4.3.6 western blot验证实验  54-55
  4.4 讨论  55-56
第5章结论  56-57
参考文献  57-61
致谢  61

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