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绵羊MHC classⅠ区段55L9 BAC克隆基因组成与结构研究

作　者: 董慧芹
导　师: 高剑峰
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: MHC BAC文库 cDNA文库 32P放射性探针 噬菌斑原位杂交
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：以中国美利奴绵羊全基因组BAC文库中MHC classⅠ区段的55L9 BAC克隆为研究对象,通过对其进行末端32P标记制备探针,采用噬菌斑原位杂交方法,从中国美利奴细毛羊cDNA文库中筛选出一个或多个绵羊MHC classⅠ区段的基因,并对筛选到得候选基因进行测序及软件分析,从而初步研究绵羊MHC classⅠ区段55L9 BAC克隆基因组成与结构。友法：(1)对中国美利奴绵羊BAC文库中的MHC区段的55L9BAC进行测序,利用网上GeneScan1.0软件预测该克隆可能存在的基因。对该克隆进行质粒提取,酶切并用Klenow聚合酶对酶切产物进行32p末端标记。利用杂交技术筛选中国美利奴绵羊cDNA文库。(2)对筛选获得到的候选阳性单克隆基因进行分子剪接,使基因克隆片段转化到PBK-CMV载体上,以便进一步的保存和测序工作。对转化后的载体质粒进行EcoR I/XhoⅠ双酶切鉴定,目的克隆片段送样测序后,利用各种生物信息学手段,对这些筛选得到的基因进行分析,并初步研究55L9BAC克隆的基因组成与结构特点。结果：55L9 BAC克隆测序结果显示,该克隆长约145kbp,共有12基因,这些基因大部分为断裂基因,其中有10个是完整基因,两端处的两个基因不完整,跨越其它克隆。经多次的原位杂交筛选,测序后,共获得15候选基因,其中有6个基因经软件比对后,被定位于55L9 BAC序列上,其它的基因虽没被定位在55L9 BAC序列上,但与NCBI上的核酸数据库比对后,显示这些基因与免疫可能有相关性,利用羊同牛在物种进化上的亲缘关系,对这些基因进行了基因注释。最后包括定位在55L9 BAC序列上的基因在内,共向GeneBnak提交了8个序列。结论：利用BAC文库与cDNA文库杂交的方法,在筛选基因方面有很大优势,首先它可以分离到全长基因进而可以展开基因功能的研究；其次是一种从文库中快速性筛选阳性克隆的有效手段,特别适应于非常大量的克隆筛选。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-7
目录  7-8
英文缩写词表  8-9
1 引言  9-19
  1.1 组织相容性复合体(MHC)的概述  9-10
    1.1.1 MHC的结构与功能  9
    1.1.2 MHC的遗传及多态性  9-10
  1.2 绵羊的MHC的概述  10-14
    1.2.1 绵羊MHC的结构与功能  10-11
    1.2.2 绵羊MHC的物理图谱  11-12
    1.2.3 绵羊MHC同其它动物MHC的关系  12-13
    1.2.4 绵羊MHC与疾病的关系  13-14
  1.3 绵羊MHC的研究现状  14-15
  1.4 cDNA文库和BAC文库  15-16
  1.5 cDNA文库的筛选方法  16
  1.6 本研究的目的及意义  16-18
  1.7 技术路线  18-19
2 材料和方法  19-25
  2.1 材料  19
  2.2 方法  19-25
    2.2.1 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9BAC克隆的基因预测  19
    2.2.2 利用GeneQuest软件分析55L9BAC克隆酶切位点并筛选限制性内切酶  19-20
    2.2.3 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9 BAC克隆菌体及XL1-Blue MRF'和XLOLR宿主菌的活化  20
    2.2.4 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9 BAC克隆质粒的提取  20-21
    2.2.5 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9BAC克隆重组质粒的酶切  21
    2.2.6 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9BAC克隆重组质粒的酶切产物浓度鉴定  21
    2.2.7 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9 BAC克隆探针的制备  21
    2.2.8 利用55L9 BAC克隆探针筛选cDNA文库  21-24
    2.2.9 测序结果查新与生物信息学分析  24-25
3 结果  25-31
  3.1 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9BAC克隆的基因预测  25-26
  3.2 利用Gene Quest软件分析55L9 BAC克隆酶切位点并筛选限制性内切酶  26-27
  3.3 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9 BAC克隆质粒的提取结果  27
  3.4 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9BAC克隆重组质粒的酶切  27
  3.5 绵羊MHC class Ⅰ区段55L9BAC克隆重组质粒的酶切产物浓度鉴定  27
  3.6 利用55L9 BAC克隆探针筛选cDNA文库  27-29
  3.7 测序结果查新与生物信息学分析  29-31
4 结论与讨论  31
5 展望  31-33
参考文献  33-37
附录  37-43
作者简介  43-44
致谢  44-45
评阅表  45

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 羊
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