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栽培花生基因组BAC文库的构建

作　者: 赵雪雅
导　师: 黄进勇
学　校: 郑州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 栽培花生 BAC文库文库构建
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

栽培花生(Arachis hypogaea L.)是异源四倍体,含有A和B两个基因组。现有研究认为四倍体栽培种是由二倍体种A.duranensis(A genome)和A.ipaensis(B genome)单一杂交后经染色体自发加倍而成。单一杂交起源、多倍化引起的生殖隔离和少数育种亲本的使用,使栽培花生基因组高度保守,遗传多样性非常有限,因此,利用遗传作图的方法分析基因十分困难。花生基因组BAC文库的构建,对利用物理图谱的方法来分析花生基因组有很大的价值,可从该文库中调取大量有用的基因,在利用基因工程技术改良作物品种性状、开展分子育种等方面发挥重要作用。本实验以栽培花生中花8号植株叶片为材料,参照已报道的BAC文库构建方法,在此基础上进行技术改进,建立了一套适用于栽培花生品种的BAC文库构建技术体系。选取幼嫩的植物叶片,得到了浓度适宜,分子量大于1Mb的高分子量DNA琼脂糖包埋块儿,选择合适的酶切条件回收到符合分子量要求的DNA大片段,通过建立高效的连接体系,到目前为止共得到25,344个重组克隆。随机挑取80个克隆经小量碱裂解法提取质粒酶切鉴定,脉冲凝胶电泳结果显示,插入片段大小在30kb-150kb之间,平均插入片段大小为80kb,空载率为1.25%。随机挑取3个BAC克隆做稳定性继代实验,连续培养100代之后,BAC克隆依然稳定,没有重排现象。本实验构建的BAC文库是我国迄今构建的第一个栽培花生BAC文库,尽管文库覆盖率到目前为止还不能满足作图和测序的需要,但是建立了一个完整高效的适用于栽培花生基因组的BAC文库构建技术体系。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-9
英文缩略表  9-10
1 文献综述  10-23
  1.1 前言  10-12
  1.2 大片段基因组文库的研究进展  12-17
    1.2.1 λ噬菌体文库  12
    1.2.2 柯斯(Cosmid)文库  12
    1.2.3 YAC文库  12-13
    1.2.4 BAC文库  13-16
      1.2.4.1 BAC载体的发展  13-15
      1.2.4.2 BAC载体的优点  15-16
    1.2.5 BIBAC载体  16-17
  1.3 BAC文库的构建流程  17-20
    1.3.1 BAC载体的制备  18-19
    1.3.2 高分子量DNA(HMW-DNA)的制备  19
    1.3.3 高分子量DNA的部分消化  19
    1.3.4 载体与高分子量DNA连接技术  19-20
    1.3.5 重组子的电击转化技术  20
    1.3.6 BAC文库的质量检测  20
  1.4 BAC文库的应用  20-23
    1.4.1 基因的图位克隆  20-21
    1.4.2 基因组物理图谱构建及基因组测序  21-22
    1.4.3 BAC-FISH  22
    1.4.4 BAC转基因技术  22-23
2 材料与方法  23-42
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 供试品种  23
    2.1.2 菌株来源  23
    2.1.3 载体来源  23
    2.1.4 主要药品及试剂  23-24
    2.1.5 主要仪器设备和耗材  24-25
  2.2 方法  25-42
    2.2.1 BAC载体的获得  25
    2.2.2 载体质量检测  25-27
      2.2.2.1 大肠杆菌EP1300电转化感受态细胞的转化效率检测  25-26
      2.2.2.2 载体质量检测  26-27
    2.2.3 大片段核DNA的制备  27-31
      2.2.3.1 材料的预处理  27
      2.2.3.2 细胞核的提取  27-29
      2.2.3.3 Plug的制备  29-30
      2.2.3.4 大片段核DNA质量检测  30-31
    2.2.4 限制性酶切  31-34
      2.2.4.1 酶切前预处理  31
      2.2.4.2 最适酶切条件的选择  31-33
      2.2.4.3 大量酶切  33-34
    2.2.5 酶切大片段的纯化回收  34-37
      2.2.5.1 酶切片段的纯化  34-36
      2.2.5.2 大片段的回收  36-37
    2.2.6 连接与转化  37-39
      2.2.6.1 预连接  37-38
      2.2.6.2 脱盐  38
      2.2.6.3 电转化  38-39
    2.2.7 空载率和插入片段大小的初步检测  39-40
      2.2.7.1 BAC DNA的提取  39
      2.2.7.2 Not Ⅰ酶切  39-40
    2.2.8 大量连接转化  40
    2.2.9 BAC克隆的挑取和BAC文库的建成  40-41
    2.2.10 文库质量检测  41-42
      2.2.10.1 插入片段大小检测  41
      2.2.10.2 克隆稳定性检测  41-42
3 结果与分析  42-51
  3.1 EP1300商用感受态和BAC载体质量的鉴定  42
  3.2 大片段DNA包埋胶块儿的制备  42-45
  3.3 部分酶切最适酶量的确定  45
  3.4 部分酶切及大片段回收  45-48
  3.5 DNA大片段的连接与转化  48-49
  3.6 插入片段大小的检测  49-50
  3.7 BAC克隆稳定性的检测  50
  3.8 文库覆盖率  50-51
4 讨论  51-54
  4.1 花生基因组BAC文库构建过程中遇到的问题  51-53
    4.1.1 针对花生细胞核提取的优化  51
    4.1.2 酶切过程遇到问题的探讨  51
    4.1.3 大片段纯化步骤的改进  51-52
    4.1.4 DNA电洗脱过程中遇到的问题  52
    4.1.5 提高连接转化效率的措施  52-53
  4.2 工作不足及下一步工作计划  53-54
参考文献  54-60
致谢  60-61
个人简历  61

栽培花生基因组BAC文库的构建

内容摘要

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