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绍兴黄酒麦曲中微生物群落结构的研究

作　者: 张中华
导　师: 陆健
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 绍兴黄酒麦曲分离培养变性梯度凝胶电泳微生物群落
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

黄酒麦曲是黄酒酿造的关键，其质量的好坏直接影响着黄酒的出酒率和品质。目前国内外关于黄酒麦曲微生物群落结构方面的研究还比较少。本研究基于传统微生物分离培养技术和以分子生物学为基础的聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术，比较全面准确地剖析了绍兴黄酒机制曲、手工曲和熟麦曲中的微生物群落结构。为准确阐述麦曲在黄酒发酵过程中的作用以及指导制曲工艺的改进提供了一定的理论基础。本研究分别利用LB培养基、YP培养基、MRS培养基和麦曲浸提液培养基、马铃薯培养基、察氏培养基对麦曲中的细菌、真菌进行了分离培养和鉴定。细菌的鉴定结果表明：机制曲中有芽孢杆菌属和葡萄球菌属的细菌；手工曲有芽孢杆菌属及少量泛菌属、肠球菌属的细菌；熟麦曲中有葡萄球菌属，还有少量泛菌属和芽孢杆菌属的细菌。真菌的鉴定结果表明：机制曲中有根霉属、横梗霉属、曲霉属、链格孢属、散囊菌属和毛霉属的真菌，手工曲中有根霉属、横梗霉属、毕赤酵母属和毛孢子菌属的真菌，熟麦曲分离鉴定出曲霉属、毕赤酵母属和毛孢子菌属的真菌。本研究还利用PCR-DGGE技术对这三种麦曲样品中的微生物进行了分析鉴定。细菌PCR-DGGE的分析结果表明，三种麦曲中均有糖多孢菌属、肠杆菌属等多个属种的细菌；而在手工曲中鉴定出了高温放线菌属的微生物，这与传统分离培养方法的结果是相互补充的。芽孢杆菌的PCR-DGGE分析表明：机制曲和手工曲中鉴定出枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，这与传统分离培养方法的结果是相互支持的，但熟麦曲中未鉴定出芽孢杆菌属的细菌。真菌的PCR-DGGE分析结果表明，三种麦曲均有疏棉状嗜热丝孢菌；机制曲和手工曲均有横梗霉属、犁头霉属的真菌；机制曲和熟麦曲有西弗冠孢酵母和黑曲霉。此外，机制曲中还有米黑根毛霉、蜡叶散囊菌和微小根毛霉等，手工曲中还有镰孢菌属等属的真菌。其中，镰孢菌属的真菌和疏棉状嗜热丝孢菌是绍兴黄酒麦曲以前未曾报道过的微生物。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章前言  7-13
  1.1 黄酒麦曲  7-8
  1.2 目前的研究进展  8-9
  1.3 聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术  9-10
    1.3.1 PCR-DGGE 的优缺点  9-10
    1.3.2 PCR-DGGE 技术的应用  10
  1.4 研究内容和意义  10-13
    1.4.1 研究意义  10-11
    1.4.2 研究内容  11-13
第二章材料和方法  13-23
  2.1 试剂和仪器  13
    2.1.1 试剂  13
    2.1.2 仪器设备  13
  2.2 麦曲样品  13
  2.3 微生物的传统分离培养  13-15
    2.3.1 培养基的配制  13-14
    2.3.2 细菌的培养  14
    2.3.3 真菌的培养  14
    2.3.4 微生物 DNA 的提取  14-15
  2.4 麦曲样品基因组 DNA 的提取  15
  2.5 PCR 扩增条件  15-19
  2.6 变性梯度凝胶的制备  19-20
    2.6.1 凝胶溶液的配制  19
    2.6.2 垂直变性梯度凝胶的制备  19
    2.6.3 水平变性梯度凝胶的制备  19-20
  2.7 DGGE 分析  20
  2.8 割胶回收和 T-A 克隆  20-21
    2.8.1 DGGE 凝胶的割胶回收  20
    2.8.2 感受态的制备  20
    2.8.3 琼脂糖凝胶的割胶回收  20
    2.8.4 连接和转化  20-21
  2.9 DGGE 条带的比对和测序  21-23
    2.9.1 阳性克隆的 PCR 验证  21
    2.9.2 DGGE 条带比对  21
    2.9.3 阳性克隆子的测序  21-23
第三章结果与讨论  23-51
  3.1 麦曲中细菌分离培养结果  23-27
    3.1.1 麦曲细菌分离培养数量  23
    3.1.2 麦曲细菌的分离培养鉴定结果  23-27
  3.2 麦曲样品基因组 DNA 的提取  27
  3.3 麦曲中细菌的 PCR-DGGE 分析  27-34
    3.3.1 麦曲细菌 V3 区 PCR 的扩增  27-28
    3.3.2 麦曲细菌 PCR-DGGE 电泳条件的确定  28-31
    3.3.3 麦曲细菌的 PCR-DGGE 电泳  31-32
    3.3.4 麦曲细菌 DGGE 条带切胶回收及鉴定结果  32-34
  3.4 麦曲中芽孢杆菌的 PCR-DGGE 分析  34-36
    3.4.1 麦曲细菌 V9 区的 PCR 扩增  34-35
    3.4.2 麦曲细菌 V9 区的 PCR-DGGE 电泳  35
    3.4.3 麦曲细菌 V9 区 DGGE 条带切胶回收及鉴定结果  35-36
  3.5 麦曲中真菌分离培养结果  36-40
    3.5.1 麦曲真菌分离培养数量  36-37
    3.5.2 麦曲真菌分离培养鉴定结果  37-40
  3.6 麦曲中真菌的 PCR-DGGE 分析  40-46
    3.6.1 引物 NS3/YM951r 的真菌 PCR-DGGE 电泳  40-41
    3.6.2 引物 NS3/YM951r 的 DGGE 条带切胶回收及鉴定结果  41-42
    3.6.3 引物 FF390/FR1 的真菌 PCR-DGGE 电泳  42-43
    3.6.4 引物 FF390/FR1 的 DGGE 条带切胶回收及鉴定结果  43-46
  3.7 不同区域机制曲微生物群落结构  46-47
  3.8 小结  47-51
第四章结论与展望  51-53
  4.1 结论  51
  4.2 展望  51-53
致谢  53-55
参考文献  55-59
附录：攻读硕士学位期间发表的论文  59

绍兴黄酒麦曲中微生物群落结构的研究

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