学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

蛋白质二聚化和在纳米颗粒表面吸附去折叠的动力学研究

作　者: 潘海
导　师: 王炜
学　校: 南京大学
专　业: 物理学
关键词: 纳米颗粒去折叠二聚化 β-乳球蛋白相互作用的尺寸效应大分子 nanoparticle 颗粒相互作用能量转移荧光基团构型变化停流蛋白吸附动力学研究表面吸附 formation 人血清白蛋白 stopped 两相的
分类号: O629.73
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 110次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

蛋白质是生命活动中一类极其重要的大分子,是生命活动的主要承担者,蛋白质生物功能的执行与其特定的天然态空间结构密切相关,它的正确折叠保证了功能的完成,而在某些特定的条件下,蛋白质会错误折叠使得其功能发生改变甚至丧失,故揭示蛋白质分子在不同环境中如何折叠成特定功能结构是分子生物学研究中的核心问题之一。其中二聚化蛋白的折叠过程一直吸引着人们的眼球,我们通过荧光共振能量转移的方法来检测两个蛋白单体之间距离随时间的变化,与蛋白本身的折叠速率相比较从而可以得出蛋白二聚化和折叠之间的协同性相关信息。我们也研究了蛋白在纳米颗粒表面的去折叠变性行为,考虑到纳米表面的特性,如带电性,疏水性和大曲率,其表面导致的蛋白变性对于纳米颗粒载药来说是一个潜在的缺点,理解蛋白在纳米颗粒表面的变性行为和过程有助于人们对纳米颗粒载体的设计进行优化。本文主要从上述两方面,以β-乳球蛋白为例研究了其二聚化的动力学过程,以GB1和人血清白蛋白(HSA)为例研究了蛋白与纳米颗粒的相互作用,并对其物理机制进行了初步探讨。本论文主要内容如下：第一章主要介绍了蛋白质、蛋白质折叠和聚集的背景,特别是蛋白质二聚化在生命体系中的重要作用。蛋白质自组装成二聚体或多聚体在生物体系里是非常普遍的现象,而最近研究表明二聚化过程在蛋白质调节中起关键作用。特定蛋白质的二聚化是整合了生物功能、结构和调控于一体的生物过程,理解其本质可以让我们对细胞乃至生命的了解更进一步。此外,在这一章里还介绍了本论文中使用的主要实验手段：停流(stopped-flow)技术和荧光共振能量转移(Forster resonance energy transfer, FRET)技术。停流技术作为生物物理史上早期进行蛋白质折叠动力学研究的主流技术,使人们对蛋白折叠/去折叠路径有了深入了解。而FRET技术为人们在分子层次研究不同生命活动体系的机制细节提供了便利。荧光共振能量转移是与距离相关的,可以直接提供生物大分子在构型变化过程中的距离变化规律,使人们能运用光学手段观测分子在运动或其在发挥生物调控功能时构型的变化过程。特别是近年来发展起来的单分子技术,使人们对生物分子的结构功能之间的关系理解得更深入。第二章中,我们介绍了用停流装置(stopped-flow)结合荧光共振能量转移(FRET)技术研究β-乳球蛋白的二聚化过程的动力学行为。在β-乳球蛋白的自由巯基(Cysl21)标记了大基团的情况下,其稳定性和二聚化状态都会受到很大影响,然而人们对其影响的机理还不是了解得十分清楚。我们针对β-乳球蛋白单体条件下,通过标记供体和受体来研究标记的荧光基团对其结构和稳定性的影响。我们发现在自由巯基修饰了荧光基团的情况下,β-乳球蛋白的二级结构发生了很大变化,a的构成明显增加了,这与其在折叠过程中发现的非天然态的α结构也是相符合的。重要的是,虽然β-乳球蛋白的二级结构受到了破坏,但是,其依然能形成二聚体,而且二聚化速率因为修饰了荧光基团对的原因明显减慢了,这样使得我们能通过stopped-flow FRET技术对其二聚化动力学进行表征。我们的结果显示β-乳球蛋白二聚化过程的发生优先于其单体折叠的完成,这个结果也为其折叠和二聚的协同性提供了证据。在第三章中,我们研究了蛋白与纳米颗粒的结合相互作用特性。由于纳米颗粒的众多特性诸如尺寸小,体表积大以及强的细胞穿透能力,使得其具有越来越广泛的医药和生物材料应用的可能性,比如载药,诊断和治疗药剂。然而我们对于其相互作用特性(特别是蛋白与纳米颗粒的相互作用)的生物本质的认识还远远落后于纳米技术本身的发展。在典型的蛋白与纳米颗粒相互作用中,两种过程：表面吸附和蛋白的构象变化,往往是混杂在一起的而没有相对定量的描述。在本章中,我们使用GB1作为模型蛋白,应用stopped-flow快速混合技术从细节上描述蛋白吸附到纳米颗粒表面并导致其部分去折叠的过程。当GB1吸附在纳米颗粒表面时,我们观测到一个两相的变性行为,这样的动力学可以表述为一个快速的平衡吸附,紧接着一个慢速的可逆去折叠过程。基于此模型,我们定量地测量了整个过程的速率常数,从而构建了其中的自由能变化。这使得我们能评估在GB1吸附到乳胶纳米颗粒和构象变化过程中环境因素的影响,比如pH值和离子强度的效应。我们希望这能加深我们对蛋白-纳米颗粒相互作用的认识,并能够在生物医药应用中对这种相互作用的控制有所帮助。第四章是我们在上一章研究的基础上,进一步从纳米颗粒的尺寸效应方面研究了其对蛋白吸附及蛋白变性作用的影响。我们使用人血清白蛋白(HSA)作为研究对象,通过CD谱得出,尺寸越大的纳米颗粒对蛋白的二级结构的扰动越大。而在动力学实验中,这个结果也得到了证明,在曲率半径更大的纳米颗粒表面上蛋白变性得更快。HSA是一个比较大的球蛋白,有可能在小尺度纳米颗粒表面上与HSA相互作用交界面因为曲率大而无法将HSA的螺旋结构撑开,这样虽然蛋白吸附到小纳米颗粒表面的速率大,但是对其二级结构破坏的作用比较小。第五章中,我们使用单分子荧光共振能量转移(sm-FRET)技术观测和研究了DNA Holliday Junction (DNA交叉结构)在缓冲液中加入Mg2+和不加Mg2+条件下的构型变化。我们使用了一种新设计的DNA交叉结构序列,将实验结果跟报道做比较,发现其构型倾向性发生了变化,并不像原始序列构成的交叉结构那样在高能量转移态和低能量转移态之间平均分布,而是倾向于一种类似原始结构的高能量转移态构型。值得注意的是,新设计的DNA交叉结构在这种高能量转移态时的能量转移效率要小于原序列,由此可以知道标记了荧光基团的两条臂之间的距离比原序列构成的交叉结构要稍大,这有可能是因为新设计的序列组成的DNA交叉结构更柔性而使得构型选择性更大。细节了解其构型变化的动力学,可以为我们设计相应的研究酶切动力学的交叉序列提供实验依据。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-11
目录  11-13
第一章前言  13-51
  1.1 蛋白质简介  13-14
  1.2 蛋白质折叠  14-20
  1.3 蛋白质的二聚化  20-23
  1.4 快速混合技术研究蛋白质折叠机制  23-37
  1.5 荧光共振能量转移(FRET)技术  37-51
第二章巯基FRET染料标记对β-乳球蛋白稳定性和二聚过程的影响  51-61
  2.1 引言  51
  2.2 材料和方法  51-54
  2.3 结果和讨论  54-60
  2.4 结论  60-61
第三章蛋白在纳米颗粒表面的吸附去折叠研究  61-79
  3.1 引言  61-62
  3.2 材料和方法  62-65
  3.3 结果和讨论  65-76
  3.4 结论  76-79
第四章纳米颗粒尺寸效应对蛋白吸附及去折叠影响的研究  79-87
  4.1 引言  79-80
  4.2 材料和方法  80-81
  4.3 结果和讨论  81-86
  4.4 结论  86-87
第五章 sm-FRET技术研究四向DNA交叉的构型变化  87-95
  5.1 引言  87-89
  5.2 材料和方法  89-91
  5.3 结果和讨论  91-94
  5.4 结论  94-95
第六章总结和展望  95-97
参考文献  97-119
发表论文  119-121
致谢  121-122

蛋白质二聚化和在纳米颗粒表面吸附去折叠的动力学研究

内容摘要

全文目录

相似论文